急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是腹部外科复杂性疾病，可由多种原因引起胰腺腺泡内酶原活化，导致腺泡细胞自身消化，继而诱导炎性细胞增多及炎性介质释放，造成局部和全身炎性反应^[1]。在AP中，轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）占比最高，约为80%~85%^[2]。目前针对AP尚无特异性治疗手段，多采取对症治疗。我国采用中西医结合治疗胰腺炎取得满意的临床疗效，但关于中医治疗胰腺炎的机制研究相对滞后，所以深入研究中药防治胰腺炎的意义重大。核因子（NF）-κB是最先从B淋巴细胞核抽提物中检测到的一种核蛋白因子，可广泛参与机体免疫、炎症反应和免疫修复，最常见形式是P50/P65二聚体，经典的活化途径是外界刺激信号通过与细胞膜上的受体结合，激活κB抑制蛋白（IκB）的激酶复合体（IKK），使IκB磷酸化，从NF-κB降解下来，解离后的NF-κB迅速从胞浆转移进细胞核，参与调节相关基因的转录^[3]。NF-κB活化后可以激活多种炎症因子表达，如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1、IL-6等。同时还可以介导白细胞的黏附聚集，导致局部炎症反应，损伤微血管内皮细胞，引起微循环障碍。Gao等^[4]通过检测发现水肿性胰腺炎模型大鼠的胰腺组织NF-κB活性明显升高。目前临床上多采用中西医结合治疗AP，中医药在其治疗中发挥重要作用。赵光等^[5]研究急性出血坏死性胰腺炎大鼠肺损伤模型，发现予清胰颗粒灌胃可以减轻大鼠的病理损伤和炎症反应，Toll样受体4（TLR4）和p38MAPK mRNA的表达显著降低。本文通过构建MAP大鼠模型，采用清胰颗粒进行治疗，研究MAP大鼠胰腺组织的病理生理变化及NF-κB信号通路的表达水平，探讨清胰颗粒治疗MAP的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选用50只清洁级雄性Wistar大鼠，体重（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，按随机数字法分为对照组（10只）、模型组（20只）和治疗组（20只），模型组和治疗组再分为2个亚组，分别在建模后12 h和24 h取材，每组各10只。本研究已通过天津市南开医院实验动物伦理审查（审批号：NYKK-DWLL-2019-090）。

1.1.2 实验试剂

雨蛙素购于美国Sigma公司；淀粉酶检测试剂盒和脂肪酶检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA检测试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于北京普利莱基因有限公司。清胰颗粒购于南开医院中药颗粒药房。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备和分组

1）对照组：腹腔注射等量生理盐水，每0.5 h注射1次，连续注射6次。2）模型组：腹腔注射雨蛙素50 μg/kg，每0.5 h注射1次，连续注射6次；第1次注射前0.5 h给予等量生理盐水灌胃，之后每间隔8 h给予生理盐水灌胃，共3次。3）治疗组：腹腔注射雨蛙素50 μg/kg，每0.5 h注射1次，连续注射6次；第1次注射前0.5 h给予中药清胰颗粒灌胃（5 mL/kg），之后每间隔8 h给予清胰颗粒灌胃，共3次。

1.2.2 标本采集及处理

造模成功后，分别在12 h和24 h，以10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，使大鼠仰卧位，四肢固定于动物手术台，腹部剪毛备皮，取腹壁正中切口，长约2 cm切开腹壁皮肤，暴露胃及十二指肠、胰腺，观察胰腺水肿、充血等改变，取腹腔静脉血，促凝管收集静置，3000 r/min离心10 min，取血清，-80℃保存备用。采血后，沿十二指肠分离获取部分胰腺组织，-80℃保存备用。剩余胰腺组织以40%甲醛溶液固定留待病理分析。

1.2.3 病理学评分标准

胰腺组织切片通过常规HE染色后，参照Schmidt评分标准^[6]，光镜下观察胰腺组织的病理学变化。

1.2.4 观察指标检测

测定大鼠血清淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LIP）活力及Ca²⁺浓度，采用ELISA法检测细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，采用Western Blot检测胰腺组织中的NF-κB-IKKβ和p65磷酸化水平，以此代表NF-κB蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

数据均用SPSS 25.0软件进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MAP大鼠胰腺组织病理学评分比较

对照组大鼠胰腺组织在肉眼下和镜下观察均无明显变化。模型组大鼠胰腺组织肉眼下可见胰腺水肿、肿胀，镜下结果可见不同程度的胰腺腺泡肿胀、有空泡形成、出血或小叶结构破坏，伴有炎性细胞浸润，并伴有轻度局灶性坏死。治疗组大鼠胰腺组织在肉眼下和镜下观察较模型组均有显著改善，见图1。建模后12 h和24 h，模型组的胰腺病理评分均高于对照组（P<0.05）；治疗组胰腺病理评分明显低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

注：^a与对照组同时点比较，P<0.05；^b与模型组同时点比较，P<0.05

2.2 各组MAP大鼠血清AMY、LIP、Ca²⁺浓度比较

建模后12 h和24 h，模型组血清AMY、LIP活力均高于对照组，治疗组血清AMY、LIP活力低于模型组（P<0.05）；模型组和治疗组建模后12 h的血清AMY、LIP均高于24 h，有统计学差异（P<0.05）。建模后12 h和24 h，模型组血清Ca²⁺浓度均低于对照组，治疗组血清Ca²⁺浓高于模型组（P<0.05）；模型组和治疗组建模后12 h的血清Ca²⁺浓均低于24 h，有统计学差异（P<0.05）。见表2。

注：^a与对照组同时点比较，P<0.05；^b与模型组同时点比较，P<0.05；^c与同组12 h比较，P<0.05

2.3 各组MAP大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

建模后12 h和24 h，模型组血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均高于对照组，治疗组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型组，有统计学差异（P<0.05）；模型组和治疗组建模后12 h的血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均高于24 h，有统计学差异（P<0.05）。见表3。

注：^a与对照组同时点比较，P<0.05；^b与模型组同时点比较，P<0.05；^c与同组12 h比较，P<0.05

2.4 各组MAP大鼠胰腺组织NF-κB蛋白表达水平比较

造模后12 h，模型组胰腺组织NF-κB蛋白表达水平均高于对照组，治疗组胰腺组织NF-κB蛋白表达水平均低于模型组；造模后24h，模型组胰腺组织NF-κB蛋白表达水平均高于对照组，治疗组胰腺组织NF-κB蛋白表达水平均低于模型组，均有统计学差异（P<0.05），见图2-3。

3 讨论

急性胰腺炎病情严重，死亡率高达22.7%，属临床难治性疾病之一，病程中常伴有胰腺外分泌功能损伤，表现为血清淀粉酶和脂肪酶升高，血钙浓度下降，合并感染时可出现白细胞、C反应蛋白等炎症指标升高。AP的发病机制复杂，相关信号通路间的相互作用尚不明确，目前NF-κB通路被认为是一条重要的信号通路，是多种信号通路共同作用的下游位点，作为核转录因子，调控多种炎症细胞因子的基因转录，这些炎性细胞因子在急性胰腺炎的发生、发展中扮演重要角色。AP机体释放大量促炎因子、抗炎细胞因子和趋化因子，引起的局部炎症反应^[7]，并可进一步激活粒细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞，导致胰腺的“二次打击”，加重胰腺损伤^[8]。

本实验通过大鼠腹腔内注射雨蛙素法诱导MAP模型，具有操作简单，稳定性强的特点，其诱导病理变化与人体发病类似^[9]。本实验结果发现MAP大鼠胰腺组织肉眼下可见胰腺水肿、充血肿胀，镜下可见不同程度的胰腺腺泡肿胀，腺泡小叶结构破坏，伴有大量炎性细胞浸润，并可见轻度局灶性坏死。且MAP大鼠的血清AMY和LIP的活力升高，Ca²⁺浓度降低；同时发现大鼠胰腺组织中NF-κB信号通路被激活，炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放水平也相应增加。

NF-κB信号通路是介导炎症反应的重要信号通路，在许多疾病中过度表达，如溃疡性结肠炎、支气管哮喘、感染性休克等。NF-κB信号通路可转录多种炎症因子的表达和释放，其中TNF-α和IL-1是最早被激活的炎症因子，并一同诱导IL-6的释放^[10]。目前各国学者将NF-κB信号通路作为胰腺炎研究的新靶点，已发现多种可以抑制NF-κB信号通路的治疗药物：1）蛋白酶抑制剂：MG132、加贝酯、TLCK等，可以通过选择性的抑制溶酶体蛋白水解酶和钙蛋白酶的活性，进而抑制NF-κB蛋白的活性。2）干扰素γ（INF-γ）：实验研究发现INF-γ基因敲除小鼠比野生型小鼠更容易出现胰腺损伤，且释放出更多的炎症因子，所以INF-γ可以抑制NF-κB蛋白的活性来减少炎症因子的释放。3）肾上腺皮质激素：肾上腺皮质激素受体被激活后可以与NF-κB-RelA亚单位发生偶联，阻止NF-κB活化后向核内转移；同时肾上腺皮质激素受体还可以与编码IκB的DNA结合，增加IκB的表达，抑制NF-κB的活性。4）噻唑烷二酮类药物：可以抑制NF-κB的活性，进而诱导单核巨噬细胞的凋亡，减少胰腺损伤。5）NBD多肽：经过NBD多肽处理过的小鼠AP模型，发现NF-κB的活性被抑制，胰腺和胰外器官的炎症损伤明显减轻^[11]。6）中药提取物，如大黄素、白藜芦醇等均可以对NF-κB的活性产生抑制作用^[12]。

本研究中清胰颗粒由柴胡、大黄、黄芩、元胡组成。方中柴胡、大黄一升一降疏肝理气，通腑泻热，导湿热外出。黄芩苦寒泄热，可以清湿热，化瘀血。元胡行气止痛，协助柴胡疏肝理气，调理全身气机，诸药相互配伍共同起到和解少阳、通阳明腑实之功效。本方将通里攻下与疏肝行气结合，起到通腑泄热、除湿利胆、解痉止痛的效果。从现代药理学角度分析，本方具有抗炎抗内毒素、调节免疫功能、保护肠黏膜屏障、改善胰腺炎微循环障碍等多种作用。本实验结果显示，治疗组MAP大鼠在胰腺组织在肉眼下和镜下的病理表现较模型组均有显著减轻，血清生化指标（血清AMY、LIP、Ca²⁺）和细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平也同样得到改善。说明清胰颗粒可以明显减少MAP大鼠胰腺的胰酶释放，减轻胰腺组织的炎症损伤，从而促进胰腺损伤的修复；可能通过改善钙ATP酶活性，降低细胞内钙离子水平，减轻胰腺组织的损伤程度；可抑制胰腺组织中NF-κB蛋白磷酸化，进而减少炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，减轻MAP大鼠的胰腺组织损伤和全身炎症反应，阻断胰腺炎的病情进展。

综上所述，清胰颗粒可下调MAP大鼠胰腺组织中NF-κB信号通路的表达，减少炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，从而减轻胰腺组织损伤，促进胰腺组织修复。本实验初步探讨清胰颗粒对MAP大鼠炎症损伤的修复机制，但中药的有效成分和具体分子作用机制仍需进一步研究。

参考文献