胰腺癌是一种源自于胰腺导管上皮和腺泡细胞的肿瘤^[1]。胰腺癌起病隐匿，早期无明显症状，直至确诊时已进展至中晚期，治疗难度极大，为预后最差的恶性肿瘤之一^[2]。目前对于胰腺癌来说，手术是常用治疗方法。但术后复发率较高，患者的5年存活率仍然较低，仅在3%～25%不等^[3]。目前，尚无明确的针对普通人群的胰腺癌筛查策略，可与结直肠癌（CRC）的结肠镜检查相媲美，并且现有的计划仅限于高危患者（家族性胰腺癌和遗传性胰腺癌综合征），占所有胰腺癌患者的5%～10%。虽然现在有300多种生物标志物可用于胰腺癌的诊断，但不存在金标准的生物标志物。循环肿瘤细胞（CTCs）是液体活检技术之一，已运用在乳腺癌、前列腺癌和肺癌等肿瘤的早期诊断、分期和预后评估中，但在胰腺癌中鲜有报道^[4]。机体炎症反应与肿瘤的发生存在一定关系，当肿瘤在机体侵袭和生长时，可使机体处于炎症反应状态。C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）是机体的炎症反应指标，由于恶性肿瘤细胞会释放细胞因子，巨噬细胞浸润或伴发感染或组织坏死，刺激肝脏合成CRP的产生，所以CRP运用在多种肿瘤的预后检测中。CAR是CRP与清蛋白（album，ALB）的比值，是多种肿瘤预后的影响因素^[5]。糖类抗原199（CA199）是一种在癌细胞表面表达的四糖糖类抗原，是胰腺癌诊断中最广为人知的血清学生物标志物。CA50是胰腺和结、直肠癌的标志物，CA50在胰腺癌和胆囊癌的阳性检出率居首位。CA199和CA50均是胰腺癌诊断和预后的敏感糖类抗原肿瘤标志物^[6]。本研究旨在探讨门静脉血CTCs、CAR、CA199/CA50联合检测对于胰腺癌切除术后生存的评估价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2020年1月我院收治的83例接受胰腺癌根治术患者作为研究对象，均符合现代肿瘤临床诊治丛书《胰腺癌》^[7]中胰腺癌的诊断标准，患者于我院初次接受胰腺癌根治术，且术后经过病理学确诊为胰腺导管腺癌。纳入标准：1）患者术前尚未接受放射治疗或化疗；2）患者TNM分期为I~III期；3）患者年龄＞18岁；4）患者既往不存在其他肿瘤病史。排除标准：1）术前已出现远处转移；2）患者围手术期非肿瘤性死亡；3）患者临床资料不完整；4）患者合并胰周血管侵犯；5）患者存在免疫系统、血液系统或炎性疾病。所有患者和家属均知情并签署知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会批准（审批号：快I 22236）。

1.2 主要试剂与仪器

上皮型探针、间质型探针和白细胞型探针均购自广州邦标医疗器械有限公司；CRP检测试剂盒购自上海梵态生物科技有限公司；ALB检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；CA199和CA50检测试剂盒均购自上海仁捷生物科技有限公司；Multiskan SkyHigh型全自动酶标仪购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 检测方法

门静脉血抽取方法：严格控制为术中局部门静脉充分暴露后标本没有进行游离前抽取。获得5 mL血样并将其转移到抗凝血管内，分别进行下列检测。1）CTCs检测：打开CTChip芯片，记录芯片编号，通过ClearCell^® FX1收集CTCs。将细胞沉淀20 μL液体重悬后，将其加入到免疫组化笔勾勒的区域中，放置通风并吹干；运用4%固定液固定15 min；运用Trition×100穿透液，使其充分接触1 h；运用PBS冲洗5 min；将一抗C45以及CK18在室温下静置30 min；运用PBS冲洗5 min，反复3次；加入二抗MS488及RB568，在室温下静置30 min；再次用PBS冲洗5 min，反复3次；用DAPI/CK18/CD45染色后，在仪器内进行观察，肿瘤细胞应位于蓝色和绿色通道内，白细胞则处在蓝色以及红色通道内。通过InCell Analyzer 2000获得CTCs数量。2）CAR：运用酶联免疫吸附实验法对CRP和ALB水平进行检测，CAR=CRP/ALB。3）CA199/CA50：运用放射免疫法对CA199进行测定，CA50则采用免疫放射度量分析法进行检测。

运用电话询问和查询复诊记录的形式对患者术后进行随访，随访的频率为3个月1次，以患者手术时间为起点，终点为患者因胰腺癌死亡（肿瘤进展因素死亡）或者随访2年结束。临床病理特征包括肿瘤部位、淋巴结转移情况、TNM分期、分化程度，以及是否存在脉管侵袭。

1.4 统计学方法

SPSS 20.0进行统计分析。计量资料以$\stackrel{-}{x}\pm s$的形式表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ²检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同病理特征患者的CTCs、CAR、CA199/CA50水平对比

CTCs、CAR、CA199/CA50水平在肿瘤部位和脉管侵袭方面，差异无统计学意义（P＞0.05）；存在淋巴结转移、TNM分期III期和低分化程度患者的门静脉血CTCs、CAR、CA199/CA50水平高于不存在淋巴结转移、TNM分期为I期-II期和中高分化程度的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 生存组与死亡组患者门静脉血CTCs、CAR、CA199/CA50水平对比

与死亡患者相比，生存患者门静脉血CTCs、CAR和CA199/CA50的水平更低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

注：^a与生存组比较，P＜0.001

2.3 门静脉血CTCs、CAR、CA199/CA50预测根治性胰腺癌切除术患者预后的灵敏度和特异度比较

CTCs、CAR、CA199/CA50三者联合对于根治性胰腺癌切除术患者预后的灵敏度和特异度均高于各项单独检测，见表3、图1。

2.4 CTCs、CAR、CA199CA50与根治性胰腺癌切除术后生存的关系

根据ROC曲线分析CTCs、CAR、CA199/CA50的截值点，将高于截值点的分为升高组，低于截值点的作为正常组。83例患者的两年内生存率为77.10%，其中CTCs正常组（n=50）的生存率为86.00%，高于CTCs升高组（n=33）的63.63%（P＜0.05，图2）；CAR正常组（n=47）的生存率为82.97%，高于CAR升高组（n=36）的69.44%（P＜0.05，图3）；CA199/CA50正常组（n=53）的生存率为88.67%，高于CA199/CA50升高组（n=30）的56.66%（P＜0.05，图4）。

3 讨论

胰腺癌是常见的恶性肿瘤，是预后最差的恶性肿瘤之一。由于胰腺癌的进展极快，术后的生存时间差异性也较大^[8-9]。因此，对于胰腺癌患者预后的预测是极为重要的^[10]。但目前临床上尚无有效的预测指标，本次研究为此展开讨论，以期为临床胰腺癌患者预后的评估提供参考。

有观点认为，肿瘤的播散在肿瘤进展途中发挥重要的作用^[11]。但常用的影像学手段无法有效地对其进行识别，而这种病灶也是术后肿瘤进展的危险因素^[12]。CTCs来自实体肿瘤的释放，可穿透周围间质组织流入血管，含有较高的活力。胰腺血供回流到肝脏的途径主要以门静脉为主，而胰腺癌细胞的传播则是通过门静脉完成^[13]。本研究对不同病理特征患者进行检测发现，存在淋巴结转移、TNM分期III期和低分化程度患者的门静脉血CTCs出现明显升高。可见，CTCs在胰腺癌的发生和发展中发挥着关键的作用。CTCs是一类肿瘤种子，具有高度的转移潜力，当找到与自身相符的环境时，可快速完成定植复制、增殖并生成新的转移灶^[14]。本研究结果显示，死亡组患者门静脉血CTCs水平显著高于生存组，这是因为胰腺癌患者术后转移多为远处转移，预后效果极差，而CTCs则在其中发挥着重要作用。肿瘤的自身种植依靠着肿瘤自身的侵袭能力和转移能力，CTCs能够自由进出血浸润的血管，自循环系统再次返回到肿瘤病灶内，促进肿瘤周边血管的形成和基质募集，从而促进肿瘤复发和转移^[15]。本研究结果显示，正常CTCs水平患者的生存率显著高于高CTCs水平患者。究其原因，CTCs不是一个独立的生物学指标，高CTCs患者往往淋巴结转移率更高，且肿瘤直径也相对偏大^[16]。CRP是肝脏所生成的急性反应蛋白，是重要的炎症反应因子。有研究认为，CRP在胰腺癌、肝癌和肺癌的预后检测方面具有重要意义^[17]。ALB是营养不良的检测指标，在长期营养状态评估中具有重要价值。恶性肿瘤患者通常处在长期营养不良的情况下，特别是在肿瘤进展时期^[18]。CAR则是在以高CRP和低ALB为基础，是预后指标。本研究结果显示，存在淋巴结转移、TNM分期III期和低分化程度患者的门静脉血CAR更高，这与既往研究结果一致^[19]。死亡组患者血清CAR显著高于生存组，提示胰腺癌患者的预后可能处在较高的免疫炎性和营养不良状态中。CAR对于肿瘤的预后影响机制并不清楚，CRP能够对肿瘤坏死和局部组织损伤而引发的炎症反应进行表达，而另一方面，肿瘤复发或转移往往存在营养不良及恶病质，对于组织功能修复和免疫功能的维持均可引起营养不良的状态^[20-22]。本研究发现，正常CAR水平生存率显著高于高CAR水平患者，提示了CAR与胰腺癌患者预后存在密切关系。

CA199是胰腺癌、胃癌、结、直肠癌及胆囊癌的相关标志物。CA199在组织中通过单涎酸神经节甙脂的状态存在，而在血清内则是类粘蛋白，大量研究证明，CA199是至今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。胰腺癌患者85%～95%为阳性，CA199测定有助于胰腺癌的鉴别诊断和病情监测^[23-24]。CA50是胰腺和结直肠癌的标志物，是最常用的糖类抗原肿瘤标志物，因其广泛存在于胰腺、胆囊、肝、胃、结直肠、膀胱、子宫，它的肿瘤识别谱比CA199广，因此它又是一种普遍的肿瘤标志相关抗原，而不是特指某个器官的肿瘤标志物。CA50在多种恶性肿瘤中可检出不同的阳性率，对胰腺癌和胆囊癌的阳性检出率居首位，占94.4%，可用于胰腺癌、胆囊癌等肿瘤的早期诊断^[25]。本研究发现，存在淋巴结转移、TNM分期III期和低分化程度患者门静脉血CA199/CA50的出现明显升高，同时，死亡患者CA199/CA50显著高于生存患者，提示胰腺癌预后死亡患者CA199/CA50明显升高。而且正常CA199/CA50患者的生存率显著高于高CA199/CA50水平患者，这提示CA199/CA50可作为胰腺癌预后的检测指标。本研究进一步展开ROC曲线分析发现，三种指标联合对于根治性胰腺癌切除术患者预后的灵敏度和特异度，均高于各项指标单独检测，提示三种指标联合检测能够弥补各项指标单独检测的不足之处，对于患者的预后和评估价值较高。

综上所述，胰腺癌术后死亡患者静脉血CTCs、CAR及CA199/CA50比值明显升高，同时，三种指标联合检测对于肝癌患者预后的评估最佳。但由于本次研究仅为回顾性研究，具体机制仍需展开多中心基础性研究，以验证此次研究的结论。

参考文献