食管癌（esophageal carcinoma，EC）是消化道常见的恶性肿瘤之一，流行病学数据显示，2018年全球食管癌发病率在恶性肿瘤中居第7顺位（6.3/10万），死亡率居第6顺位（5.5/10万）^[1]。中国是食管癌高发区，新发病例和死亡病例分别占全球总数的53.7%和55.7%，在我国恶性肿瘤的发病及死亡率中分别居第5和第4顺位^[2]。中晚期食管癌的手术及其他治疗风险较高，并发症多，5年生存率不足20%^[3]，造成较高的疾病负担。因此，食管癌早期防治的重要性愈发突出，将防治目光由食管上皮的癌变前移至食管癌前病变，对食管癌的防控具有积极意义。食管癌前病变指已证实与食管癌发生密切相关的病理变化，是正常食管上皮向食管癌转化的中间过程^[4]。抑制食管癌前病变进一步向食管癌转化是临床防治食管癌的关键之一。因此，积极治疗食管癌前疾病，防止食管上皮异常增生是防治食管癌前病变的关键。

随着现代医学的结合，探讨中医药治疗机制也越来越深入，对食管癌及癌前病变发生发展过程中信号转导通路的干预措施也更加广泛。Caspase-3/Bcl-2/Bax为常见的影响肿瘤发生发展的信号转导途径^[5-6]，研究表明，线粒体与疾病的发生有着密切联系，线粒体在细胞凋亡中又起着决定性的作用，而凋亡抑制是食管癌及癌前病变的特点之一。因此，通过影响线粒体凋亡途径调节Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达^[7-8]，促进食管鳞癌及癌前病变细胞的凋亡，对食管鳞癌的发生发展具有一定的影响。本研究基于细胞凋亡信号通路Caspase-3/Bcl-2/Bax途径研究旋覆代赭汤加减方对食管癌前病变模型大鼠的作用，以探讨其可能的作用机制，为中医药临床提供一定的借鉴和指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

48只8周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量为（180±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2016-0006]，本研究经天津市医药科学研究所动物伦理委员会批准通过。

1.1.2 实验器材与试剂

PCR扩增仪PTC-300、全自动多功能化学发光分析系统ChemiDoc XRS（美国Bio Rad公司），实时荧光定量PCR系统7500（美国Thermo Fisher Scientific公司），Caspase-3、Bcl-2、Bax、GADPH抗体（美国CST公司），反转录试剂（北京全式金生物技术有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（南京森贝咖生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组与造模

将48只大鼠平衡性饲养7 d后，随机分为4组：空白组、模型组、中药组（加味旋覆代赭汤）、西药组（雷贝拉唑+莫沙必利），每组各12只。除空白组外，其余三组分别予亚硝胺类前体物质肌氨酸乙酯盐酸盐+亚硝酸钠进行化学诱导3周（化学诱导剂水溶液制备：将肌氨酸乙酯盐酸盐按4 g/kg剂量溶于0.01 mol/L盐酸中配成40%的溶液，亚硝酸钠按0.6 g/kg剂量溶于0.01 mol/L盐酸中配成6%的溶液，再将二者等量混合后灌胃），3次/周，给药3周，所用剂量根据动物体质量变化调整（每周称量），3周后，对需造模组大鼠采用“食管-十二指肠端侧吻合术”制作食管癌前病变（食管上皮异型增生）大鼠模型。

1.2.2 药物制备

中药药液配制：加味旋覆代赭汤每副颗粒剂相当于生药：旋覆花15 g，赭石5 g，半夏15 g，人参10 g，生姜25 g，炙甘草15 g，大枣10 g，枳实10 g，生白术30 g，酒大黄6 g，全部购自天津红日康仁堂药业有限公司。中药药液制备：将上述中药颗粒剂倒入清洁的烧杯内，加入100℃左右的水300 mL搅拌后，用微波炉加热30 s，使之充分溶解，每份配置成33 mL浓缩药液，按0.3 mL/100 g剂量灌胃。西药混悬液配制：雷贝拉唑钠肠溶胶囊（微丸型）（雨田青，国药准字 H20050228）10 mg，枸橼酸莫沙必利片（瑞琪，国药准字H19990315）15 mg，将雷贝拉唑钠胶囊外衣去除，与枸橼酸莫沙必利片一起碾压成细末，加入提前计算好的蒸馏水，震荡摇晃，使充分溶解，配制为33 mL混悬液，根据大鼠体质重，以0.3 mL/100 g的剂量灌胃。

1.2.3 给药方法

术后第14天，中药组、西药组大鼠分别给予药物干预，空白组、模型组予0.3 mL/100g的生理盐水灌胃，中药组、西药组分别用加味旋覆代赭汤药液、西药（雷贝拉唑钠+莫沙必利）混悬液灌胃，药物剂量按0.3 mL/100g，1次/d，每周称重调整灌胃剂量，共给药8周。

1.2.4 处死与取材

各组动物进行处死前，均予禁食1 d不禁水，然后采用10%水合氯醛（0.3 mL/100g）腹腔注射麻醉，自吻合口以上约0.5 cm处剪取长度1.0 cm的食管组织，清洗后纵切为两份，分别放入福尔马林固定液及-80℃冰箱保存，用于病理检测及后期实验检测。

1.2.5 观察指标和检测方法

1.2.5.1 一般情况

观察动物皮毛光泽、活动状态、纳食饮水、反流（口角流涎）及体质量等情况。为减少大鼠体质量误差，称重尽量选择同一台体重秤，于规定时间和固定人员进行体质量称量。

1.2.5.2 食管上皮镜下病理观察

镜下病理表现观察：按照常规流程制作病理切片，并进行HE染色，用光镜观察食管上皮病理表现并进行病理评分，评分标准参考反流性食管炎诊断及治疗指南（2003年）^[9]，见表1。

注：分级积分标准：正常、轻度、中度、重度分别为0、1、2、3分

1.2.5.3 Western-blot法检测食管组织中的Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平

取30 mg食管组织，加入300 μL RIPA裂解液，裂解离心后吸取上清；用BCA法来测定总蛋白浓度，用分光光度计在570 nm波长处测量吸光度，由此得到标准曲线及回归方程，并对待测样品的蛋白质浓度进行计算；进行SDS-PAGE电泳，结束后电转移至PVDF膜上，洗膜后加入一抗（按照比例1⁚1000的0.01MPBS进行稀释，需要全部覆盖膜），再次洗膜，加入二抗（比例同一抗），洗膜4次后发光显影，用凝胶成像分析系统对目的条带进行扫描和密度分析，以相应蛋白条带的平均光密度值来表示相对蛋白表达水平。

1.2.5.4 RT-PCR检测食管组织中的Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达水平

取30 mg食管组织，加入1 mL Trizol裂解液，提取总RNA，取1 µL的RNA进行含量测定；对失活TransScript® RT/RI和gDNA Remover进行加热（温度85℃，时间5 s）；cDNA的第一链可以作为模板用于PCR扩增。各基因引物由生物工程（上海）有限公司合成，见表2。根据说明书步骤依次加入以下试剂（最终为20 µL反应体系）：在8连管中分别加入1 μL cDNA，1 μL上游引物，1 μL下游引物，10 μL 2×qPCR SuperMix，7 μL无RNA酶水。离心后，置于实时荧光定量PCR系统7500中，并设置扩增程序：第一步，95℃ 5 min，第二步95℃ 10 s，第三步60℃ 30 s，设定循环数为45次，反应结束后导出数据，利用2^-ΔΔct法分析数据。

注：GAPDH为内参

1.3 统计学方法

数据运用SPSS 26.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间食管黏膜上皮不典型增生分级积分比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况变化及死亡原因分析

空白组大鼠未见特殊异常，体质量逐渐增长，行动灵活，口周无反流淡黄色或白色液体现象；其余三组均有不同程度的纳食减少、体质重下降、喜静喜扎堆、颤抖、易受惊吓、眼神呆滞迷离，皮毛耸立、脱落、泛黄无光泽，口周流涎（反流）等现象，部分大鼠出现腹大现象；经过8周药物干预，中药组和西药组大鼠的一般状况均见好转，体质量逐渐上升，口周反流及腹大现象几无。空白组的大鼠在整个实验过程中无一例死亡，其余三组大鼠共死亡10只，其中模型组5只，中药组2只，西药组3只；各组剩余大鼠分别为模型组7只，中药组10只，西药组9只。具体死亡情况见表3。

2.2 各组大鼠食管黏膜光镜下观察

在光镜下观察食管上皮组织，空白组大鼠的食管黏膜表面有非角化复层鳞状上皮，在基底细胞层，则有少量黑色素母细胞和内分泌细胞布散；模型组大鼠食管上皮有广泛的炎细胞浸润，更有食管上皮增厚、角化亢进，局部可见鳞状上皮异型增生，且有嗜酸性粒细胞的病变。中药组大鼠食管黏膜上皮，可见基层炎细胞减少或消失，角化降低，鳞状上皮的层次减少；西药组食管黏膜上皮，可见基层炎细胞或减少或消失，角化降低，以及鳞状上皮异型增生大大减轻，见图1。与空白组比较，模型组大鼠食管黏膜病理积分升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，中药、西药组大鼠食管黏膜病理积分降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；中药组与西药组食管黏膜病理积分差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

注：^a与空白组比较，P＜0.01；^b与模型组比较，P＜0.05

2.3 各组大鼠食管组织Caspase-3的表达水平比较

与空白组比较，模型组大鼠Caspase-3 mRNA及蛋白表达均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药、西药组大鼠Caspase-3 mRNA及蛋白表达均增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；西药组与中药组Caspase-3 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图2~4。

2.4 各组大鼠食管组织中Bcl-2的表达比较

与空白组比较，模型组大鼠食管组织中Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平均不同程度升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和西药组Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；西药组与中药组Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图5、6、7。

2.5 各组大鼠食管组织中Bax的表达变化结果

与空白组相比，模型组大鼠Bax mRNA及蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠Bax mRNA及蛋白表达均增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；西药组与中药组Bax mRNA及蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图8、9、10。

3 讨论

食管癌前病变指已证实与食管癌发生密切相关的病理变化^[4]，食管鳞状上皮内瘤变（异型增生）及巴雷特食管相关上皮内瘤变（异型增生）均属癌前病变^[10-11]。中医学并无食管癌前病变的病名，临床上根据症状将其归属于“噎膈”“泛酸”等范畴。历代医家认为该病与中焦气机有密切关系。巢元方·《诸病源候论》云：“咽喉者，脾胃之候也”，咽喉和脾胃上下相连，乃脾胃之门户也。“咽喉者，阴阳升降之路也”，常态下，脾主升，胃主降，纳入之水谷精微方可吸收及输布，余下之糟粕方能下传而排出体外。若脾升清无能，胃降浊无力，致气机升降紊乱，则浊气反逆而上，食道受戕，可表现为泛酸、烧心、咽喉不适、恶心、胸骨后不适感甚至吞咽困难等食管病变的典型症状，久而久之影响食管上皮组织改变，进而发展为异型增生，是为食管癌前病变。本课题组根据多年临床经验，提出气机升降失调与食管癌前病变的发病密切相关，是食管癌前病变的主要发病条件。认为本病的病机为中虚气逆，中虚为本，气逆为标，标实但本虚，本虚则为脾胃之本虚弱，阻碍气机的正常运转，致胃气不得正常通降，上逆而犯食道，久积而致食管上皮受损，致使本病发生。

现代医学研究发现，线粒体与疾病的发生有着密切联系，线粒体在细胞凋亡中起着决定性的作用，而凋亡抑制是食管癌及癌前病变的特点之一^[12]，故通过上调Caspase-3、Bax的表达来促进食管鳞癌及癌前病变细胞的凋亡，影响线粒体凋亡途径，可以延缓食管鳞癌的发生和发展^[13]。因此，在食管癌前病变过程中，细胞内的凋亡信号能激活线粒体途径，诱导相关蛋白释放线粒体促凋亡蛋白及凋亡诱导因子，激活Caspase级联反应^[14]。

Caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路是通过线粒体途径调控细胞凋亡的经典信号通路，通过诱导细胞凋亡，从而影响体液免疫中多种炎症因子，参与免疫应答，成为食管癌前病变重要的发病基础。实验结果表明，与模型组比较，加味旋覆代赭汤组和西药组Bcl-2含量降低，Caspase-3及Bax含量升高。但加味旋覆代赭汤组与西药组的Bcl-2、Caspase-3及Bax水平无明显差异。以上结果提示加味旋覆代赭汤可能通过线粒体途径下调Bcl-2/Bax比值，激活Caspase-3，诱导食管癌前病变食管上皮细胞的程序性死亡，扭转食管上皮异型增生，减轻食管黏膜的炎症，从而起到治疗作用。

从宏观角度，加味旋覆代赭汤组方中，根据各中药的属性和特点将其分为苦降胃气组（旋覆花、赭石、半夏、枳实、酒大黄），甘升补中气组（人参、白术、大枣、炙甘草）与和中气组（炙甘草、生姜、大枣），三组药物有升有降，共奏补虚和胃降逆之功效。脾胃虚弱为食管癌前病变的发病基础，胃气上逆为食管癌前病变的发病条件，加味旋覆代赭汤组方中甘升补中气组之人参、白术、大枣、甘草性温味甘，健脾益气，补中虚以促进脾胃气机的升降恢复正常。从人体机能学角度出发，加味旋覆代赭汤中此组药物可以增加能量物质三磷酸腺苷（ATP）的产生，及时迅速转运线粒体，维持机体的物质能量代谢的正常有序进行，进而提高机体免疫力，减轻食管黏膜上皮炎症反应，促进损伤修复。以甘温药物，温补脾胃，扶正以祛邪，从而达到“消炎”的作用。胃以“通降”为顺，加味旋覆代赭汤中苦降胃气组药物旋覆花、赭石、半夏、枳实、酒大黄，降逆气，化痰气，除水气，推陈致新，与甘升补中气组相辅相成，使降中有升，但降为主要，使脾升胃降，清阳浊阴皆归其道，则脾胃功能恢复正常，疾病方可得愈。和中气组之炙甘草、生姜、大枣调和脾胃，使甘升苦降适度相宜。全方药物结合，补中虚，降逆气以增强胃肠动力，从而减少反流，减轻反流对食管黏膜上皮的损害，使食管上皮受损组织得以修复；散结气以消食管黏膜上皮有形之邪，从而起到治疗食管癌前病变的作用。

从微观来看，有研究证实，旋覆代赭汤加减方可明显降低大鼠食管组织线粒体的表达量，参与能量代谢，稳定大鼠食管组织线粒体膜电位^[15]。加味旋覆代赭汤基本病机为“中虚气逆”，气逆是气的运动变化失常的一种，“气”的物质属性是“线粒体”，Caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路通过改变线粒体外膜通透性介导细胞凋亡，因而可能也同样改变气的运动，调节气机升降，进一步证实加味旋覆代赭汤从“气机升降”理论调治食管癌前病变的有效性。接下来的研究可再深入探讨加味旋覆代赭汤治疗食管癌前病变的机制，为临床防治食管癌及癌前病变提供一定的借鉴和指导。

综上所述，本研究证明加味旋覆代赭汤可能通过上调Caspase-3、Bax蛋白表达的水平，下调Bcl-2蛋白表达的水平，从而下调Bcl-2/Bax比值，诱导食管癌前病变食管黏膜上皮细胞凋亡，促进食管黏膜损伤的修复，减轻炎症反应，从而不同程度逆转食管癌前病变模型大鼠食管上皮不典型增生，防止疾病的继续演化。

参考文献