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创面的形成原因主要包括外伤性、糖尿病性、压力性、血管病变[1]等，其迁延不愈给患者及其家庭乃至社会造成了极大的生理、心理和经济负担。美国疾控中心数据表明[2]，60%以上的创面存在着细菌感染，感染是导致创面延迟愈合的主要原因[3]。近年来，抗生素骨水泥作为一种以聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）为主要成分的化合物，局部运用于糖尿病足溃疡、烧伤创面等伴有感染的创面中疗效显著[4-5]。但随着抗生素耐药率日益升高，挖掘可与之相媲美的药物用于局部治疗显得尤为重要。中药外治法历史悠久，许多研究[6-8]表明清热解毒类的中药外治感染性创面疗效显著，本课题组前期研究[9-11]亦表明，将军散（君药为大黄）创周箍围以感染为主的创面，可减轻创周水肿，减轻创面局部炎症反应，降低创面白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，改善微循环从而促进创面愈合，对全身的炎症反应亦有抑制作用。大黄素（emodin，E）作为大黄主要有效成分之一，具有较强的抑菌[12]和抗炎作用[13]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作为炎症反应的主要调节剂[14]，可被Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）激活[15]，介导IL-6、TNF-α等表达，在炎症反应中起到关键作用[16]。因此，本研究拟通过观察大黄素骨水泥干预后创面愈合情况、菌落数变化、HE染色病理切片、血清及组织中IL-6、TNF-α的水平变化以及TLR4/NF-κB蛋白表达变化，探讨大黄载药骨水泥对感染性创面修复的作用及机制。
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1 材料与方法
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1.1 实验动物
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5 周龄雄性SPF级Wistar大鼠60只，体质量约为（180±200）g，购自上海雷根生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0010，普通饲料和清洁饮用水喂养，适应性饲养7 d后开始实验。伦理编号为：PTSHUTCM220913007。
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1.2 主要药物、试剂
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贺利氏骨水泥（PMMA，北京雷德睦华医药科技公司），万古霉素（国药准字号：H20140174，希腊VIANEX公司），大黄素（纯度98%，上海士峰生物科技有限公司），金黄色葡萄球菌（ATCC-25923，上海士峰生物科技有限公司），异氟烷（兽药字153717015，青岛欧博方医药科技有限公司），苏木精-伊红染色液（珠海贝索生物技术有限公司），ELISA试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司），RT-qPCR试剂盒及其引物（日本TAKARA公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0009，上海碧云天生物技术有限公司），兔抗TLR4单克隆抗体（AF7017）、兔抗NF-κB p65单克隆抗体（AF5006），HPR标记抗兔二抗（WB0177），β-actin内参（WB0196，上海碧云天生物技术有限公司）。
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1.3 主要仪器
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全温大容量恒温摇床（上海知楚仪器有限公司），霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司），多功能酶标仪（美谷分子仪器上海有限公司），Supcre菌落计数仪（杭州迅数科技有限公司），实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems），全自动化学发光成像分析系统（上海天能科技有限公司）。
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1.4 菌液制备
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根据文献[17-18]的方法制备金黄色葡萄球菌（以下简称“金葡菌”）混悬液，通过酶标仪，于600 nm波长处检测其光密度（optical density，OD）值[19]，筛选出所需浓度为1×107 CFU/mL的金葡菌混悬液。
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1.5 分组、造模及给药干预
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1.5.1 分组
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60 只大鼠编号后随机分为空白组（正常饲养，无创面无干预）、模型组、大黄素骨水泥组（PMMA+E）和万古霉素骨水泥组（PMMA+V），每组15只。
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1.5.2 造模
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根据李文华等[20]的方法制备大鼠背部皮肤全层切除的感染性模型，48 h后出现创周红肿、创面大量渗出伴有黄腐为造模成功，造模前后均保持正常喂养。
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1.5.3 给药干预
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造模成功后根据药物：骨水泥=1︰20的比例[21]，将大黄素粉剂（2 g）、万古霉素粉剂（2 g）分别加入到骨水泥（40 g）中混匀，覆盖于创面，不超出创周边缘，用医用弹力绷带固定。
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1.6 大鼠创面愈合面积测定
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干预后第1、7、14天，自模型组、大黄素骨水泥组和万古霉素骨水泥组中随机选取5只大鼠，拍摄创面照片，用Image J分析创面面积。
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1.7 大鼠创面菌落数测定
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干预后第7、14天，取模型组、大黄素骨水泥组和万古霉素骨水泥组的0.1 g创面组织进行匀浆（研磨仪120 s，65 Hz，24℃），取100 μL的组织匀浆液按照10倍连续稀释法进行稀释，取不同浓度的稀释液100 μL于胰蛋白酶大豆琼脂培养基（TSA）平皿中摇匀培养24 h（37℃，湿度30 %）；通过菌落计数仪计算菌落数。
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1.8 创面组织HE染色
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干预后第7、14天，将取下的创面组织泡入4%多聚甲醛中固定，进行常规包埋、冷冻、切片、脱蜡、染色、脱色、脱水等步骤进行HE染色，在镜下（200倍）观察新生血管及炎症细胞浸润情况。
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1.9 ELISA检测大鼠血清中IL-6、TNF-α含量
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干预后第7、14天，先将大鼠腹主动脉血离心，取上清，设置标准孔和样本孔，每孔设3个复孔，根据试剂盒说明操作，在450 nm波长处测各孔OD值。
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1.10 RT-qPCR法检测大鼠创面及诱导膜中IL-6、TNF-α含量
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干预后第7、14天，先将创面组织匀浆离心后进行RNA抽提，反转录为cDNA，随后进行RT-qPCR，反应体系：10 μL双链DNA染料、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2 μL cDNA，加水至总体系20 μL，反应条件为95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，共40个循环，以β-actin为内参，基因序列见表1。计算样本的相对表达量＝2－∆∆CT。
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1.11 Western-Blot检测创面TLR4/NF-κB蛋白表达
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干预后第7、14天，将大鼠创面组织剪碎裂解离心，取上清用BCA试剂盒测样本蛋白浓度，灌胶，上样40 μg电泳分离蛋白并转移到PVDF膜上，转膜结束放入5 %BSA室温封闭2 h，加入TLR4抗体（1︰1 000）、NF-κB p65抗体（1︰1000）、β-actin抗体（1︰1 000）4℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次，加入HRP标记抗兔二抗，室温孵育2 h；TBST洗膜15 min×5次，加显影剂，上机显色，以β-actin为内参，以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值代表目的蛋白表达量。
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1.12 统计学方法
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使用SPSS 24.0软件对获得数据进行统计学分析，参数检验中符合正态性、方差齐性采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验；不符合正态性、方差齐性的采用非参数检验中的Kruskal-Wallis检验；P＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 PMMA+E对创面面积的影响
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干预后第1天，三组间创面面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）；干预后第7天和14天，与模型组比较，PMMA+E组和PMMA+V组面积明显缩小（P＜0.01），与PMMA+V组比较，PMMA+E组创面面积明显缩小（P＜0.05）。见表2、图1。
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注：a与模型组比较，P＜0.05；b与PMMA+V组比较，P＜0.05
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图1 不同时间点各组创面面积对比
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2.2 PMMA+E对创面菌落数的影响
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干预后第7天和第14天，PMMA+E组和PMMA+V组的菌落数均低于模型组（P＜0.01）；但PMMA+E组与PMMA+V组比较无明显差异（P＞0.05）。见表3、图2。
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注：a与模型组比较，P＜0.05
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图2 各组间菌落数对比
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2.3 PMMA+E对创面病理的影响
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HE染色结果显示，与正常大鼠皮肤组织比较，第7天的模型组创面可见表皮大片坏死，大量炎细胞浸润，深部肉芽组织增生；PMMA+V组创面可见表皮大片坏死，中量炎细胞浸润，大量肉芽组织增生，新生血管中等；PMMA+E组创面可见表皮大片坏死，中量炎细胞浸润，大量肉芽组织增生，新生血管丰富。第14天的模型组创面仍可见表皮大片坏死，大量炎细胞浸润，大量肉芽组织增生；PMMA+V组创面可见表皮大片坏死，少量炎细胞浸润，大量肉芽组织增生，新生血管中等； PMMA+E组创面可见表皮大片坏死，少量炎细胞浸润，大量肉芽组织增生，新生血管丰富。见图3。
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图3 各组创面HE染色（×200）
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2.4 PMMA+E对血清IL-6、TNF-α的影响
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与空白组比较，干预后第7天和14天，模型组的血清IL-6、TNF-α均升高（P＜0.05）；干预后第7天，PMMA+E组和PMMA+V组的IL-6、TNF-α比模型组明显下降（P＜0.05）。干预后第14天，PMMA+E组IL-6、TNF-α比模型组明显下降（P＜0.05），PMMA+V组IL-6比模型组明显下降，而TNF-α无明显差异（P>0.05）。见表4。
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注：a与空白组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05；c与PMMA+V组比较，P＜0.05
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2.5 PMMA+E对创面IL-6、TNF-α mRNA含量的影响
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与空白组比较，干预后第7天和14天，模型组的IL-6、TNF-α mRNA含量均升高（P＜0.05）；干预后第7天，PMMA+E组与模型组比较IL-6、TNF-α明显下降（P＜0.05），与PMMA+V组比较TNF-α明显下降（P＜0.05）。干预后第14天，PMMA+E组与模型组比较IL-6、TNF-α明显下降（P＜0.05）。见表5。
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注：a与空白组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05；c与PMMA+V组比较，P＜0.05
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2.6 PMMA+E对创面TLR4/NF-κB的影响
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与空白组比较，干预后第7天和14天，模型组的TLR4、NF-κB蛋白含量均升高（P＜0.05）；干预第7天和14天，PMMA+E组与模型组比较TLR4、NF-κB p65蛋白含量均下降（P＜0.05）。见图4、表6。
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图4 各组创面组织TLR4/NF-κB蛋白表达条带
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3 讨论
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感染性创面临床常表现为局部红肿热痛，创面脓性分泌物多，腐臭气味明显，伴有全身发热，白细胞升高，严重者可出现脓毒血症甚至感染性休克[22]，如未及时治疗，可能导致患者截趾截肢风险增加。在治疗过程中，控制创面局部感染是促进创面愈合的关键[23-24]，研究表明[24]，大黄素可有效降低IL-6、TNF-α等炎症因子水平，有效促进创面愈合[25]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中和创面中IL-6及TNF-α水平较空白组明显升高，提示感染性创面可引起机体炎症因子水平紊乱。大黄素骨水泥干预后的大鼠血清中和创面中IL-6及TNF-α水平降低明显，且创面面积较模型组及万古霉素骨水泥组的缩小明显，提示大黄素可改善感染性创面引起的炎症因子水平紊乱，进而抑制大鼠体内炎症反应，促进创面愈合。
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注：a与空白组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05
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大黄素是存在大黄中的一种天然蒽醌衍生物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等作用[26]。金黄色葡萄球菌作为创面分泌物培养最常见的菌种[27]，常定植于创面难以消除。研究发现[12]，大黄素能够通过破坏细菌生物膜从而达到对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制。本研究结果表明，大黄素骨水泥组的创面菌落数相较于模型组有明显地减少，与万古霉素骨水泥比较无明显差异，提示大黄素能有效抑制创面中金黄色葡萄球菌的生长，从而达到促进创面愈合的可能。
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TLR是保护性免疫哨兵，能特异性地识别病原相关分子模式[28]，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，介导IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达，引起相应炎性介质的合成和释放，激活中性粒细胞、淋巴细胞等。NF-κB作为炎症反应的主要调节剂，可被TLR4激活[29]，通过调节编码促炎性细胞因子基因的基因转录，参与免疫反应、细胞增殖与分化，在炎症反应中起关键作用[30]。研究发现[31]，TLRs/NF-κB信号通路与创面愈合有关。本实验结果表明，与空白组比较，模型组TLR4、NF-κB水平均明显升高，与IL-6、TNF-α水平升高一致，表明在感染中TLR4、NF-κB可能被炎症因子激活。给予大黄素骨水泥干预后，大鼠TLR4及NF-κB水平明显降低，提示大黄素可降低TLR4、NF-κB水平，从而促进创面愈合。
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综上，外用大黄素能有效抑制金黄色葡萄球菌生长，抑制感染性创面大鼠血清炎症因子水平以及创面炎症因子水平，从而促进创面愈合，其作用机制可能与TLR4/NF-κB信号通路有关。
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摘要
目的：观察大黄素载药骨水泥对感染性创面修复的作用及其作用机制。方法：60只大鼠均分为空白组、模型组、大黄素骨水泥组（PMMA+E）和万古霉素骨水泥组（PMMA+V），除空白组外均构建金黄色葡萄球菌感染的大鼠背部全层皮肤切除模型；于干预后第1、7、14天观察大鼠创面面积愈合情况；于干预后第7、14天检测各组创面菌落数，HE染色法观察创面组织病理学变化，ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量，RT-qPCR法检测创面中IL-6、TNF-α mRNA表达水平；Western-Blot检测创面中TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达水平。结果：干预后第7、14天，与模型组、PMMA+V比较，PMMA+E组大鼠创面面积明显缩小（P＜0.05）。与模型组比较，PMMA+E组菌落数明显减少（P＜0.05）；PMMA+E组与PMMA+V组比较无明显差异。与模型组、PMMA+V组比较，PMMA+E组HE染色可见炎症细胞浸润减少，大量血管新生。与模型组、PMMA+V组比较，PMMA+E组大鼠血清IL-6、TNF-α含量明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，PMMA+E组大鼠创面IL-6 mRNA含量明显降低（P＜0.05）；PMMA+E组与PMMA+V组比较无明显差异。与模型组、PMMA+V组比较，PMMA+E组大鼠创面TNF-α mRNA含量明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，PMMA+E组大鼠创面组织中Toll样受体4（TLR4）、NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05）；PMMA+E组与PMMA+V组比较无明显差异。结论：外用大黄素能有效抑制金黄色葡萄球菌生长，抑制感染性创面大鼠血清炎症因子水平以及创面炎症因子水平，从而促进创面愈合，其作用机制可能与TLR4/NF-κB信号通路有关。
Abstract
Objective To observe the effect of Emodin-loaded bone cement on the repair of infectious wound and to study the mechanism. Methods Sixty rats were divided into normal group, model group, emodin-loaded bone cement group (PMMA+E) and vancomycin bone cement group (PMMA+V), except for the blank group, a model of total skin excision on the back of rats infected with Staphylococcus aureus was constructed. The number of colonies in each group was measured on days 1, 7 and 14 after the intervention, and the histopathological changes of the wounds were observed by HE staining, IL-6 and TNF-α in the serum of rats were detected by ELISA, and IL-6 and TNF-α in the wounds were detected by RT-qPCR. Western-Blot detection of TLR4/NF-κB signaling pathway protein expression levels in wounds. Results On days 7 and 14 after the intervention, the wound area of rats in the PMMA+E group was significantly reduced compared with the model group and PMMA+V group(P < 0.05). Compared with the model group, the number of colonies in the PMMA+E group was significantly reduced (P＜0.05); compared with the PMMA+V group, there was no significant difference. Compared with the model group and PMMA+V group, HE staining in the PMMA+E group showed a decrease in inflammatory cell infiltration and a large number of new blood vessels. Compared with the model group and PMMA+V group, the serum IL-6 level was significantly lower (P＜0.05) and TNF-α level was significantly lower (P＜0.05) in the PMMA+E group. Compared with the model group, the wound IL-6 mRNA content of rats in the PMMA+E group was significantly lower (P＜0.05); compared with the PMMA+V group, there was no significant difference. Compared with the model group and PMMA+V group, the wound TNF-α mRNA content of rats in the PMMA+E group was significantly lower (P＜0.05). Compared with the model group, the expression of TLR4 and NF-κB protein in the traumatic tissue of rats in the PMMA+E group was reduced (P＜0.05); compared with the PMMA+V group, there was no significant difference. Conclusion Topical emodin can effectively inhibit the growth of Staphylococcus aureus and suppress the serum inflammatory factor level as well as wound inflammatory factor level in rats with infected wounds, thus promoting wound healing, and its mechanism of action may be related to TLR4/NF-κB signaling pathway.
