-
目前，激素已经广泛应用于各类临床治疗当中，激素性股骨头坏死发生率逐年升高，已成为非创伤性股骨头坏死的主要致病因素[1-3]。激素性股骨头坏死致残率较高，但其确切的发病机制尚不清晰[4-5]。三七皂甙R1（notoginsenoside R1，NGR1）是传统中药三七的特征性成分，具有抗细胞凋亡、自噬激活、抗炎、多种生物学活性[6-7]。研究表明三七皂甙可以抑制骨髓核细胞炎症反应[8]，还可以调控骨组织成骨破骨代谢[9]，但是三七皂甙是否在股骨头坏死中发挥作用目前尚不清楚。WNT/β-catenin信号通路是股骨头坏死调控的重要通路[10]，但三七皂甙是否可以通过调控WNT/β-catenin参与股骨头坏死过程尚不清晰。本研究将建立大鼠雌激素性股骨头坏死模型，探究不同浓度三七皂苷对股骨头坏死的保护作用及其分子机制。
-
1 材料与方法
-
1.1.1 材料
-
50 只8周龄SPF级雌性SD大鼠，体质量（220±20）g，购于北京百奥赛图基因生物技术有限公司（SYXK（京）2020-0047），本实验经张家口第二医院伦理委员会审批通过。
-
1.1.2 药品与试剂
-
NGR1标准品（货号:N3915，纯度≥ 98%）购于美国Sigma公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，总mRNA提取试剂盒（货号：195637）由北京百泰克生物科技有限公司提供，抗酒石酸碱性磷酸酶（TRAP）、尿Ⅰ型胶原交联N末端肽（U-NTX）、骨碱性磷酸酶（BALP）、雌二醇（E2）、尿型胶原交联C末端肽（U-CTX）、骨钙蛋白（BGP）均由江苏菲亚生物科技有限公司提供。
-
1.1.3 主要仪器
-
Microfuge20/20R台式离心机购自美国贝克曼公司；微孔板读数酶标仪购自美国赛默飞公司；循环超级恒温水浴锅购自常州高德仪器制造有限公司；超纯水系统购自美国MiliQ有限公司；Prodigy Pro X射线骨密度检测仪购自美国GE公司。7500 qPCR仪购自美国ABI公司；Western blot电泳仪购自美国BIO-RAD公司。
-
1.2 方法
-
1.2.1 大鼠模型构建及分组
-
采用腹腔注射甲基强的松龙的方法构建大鼠激素性股骨头坏死模型，注射周期为3周，模型组和治疗组分别在每周前3天连续注射甲基强的松龙20 mg/（kg·d），对照组大鼠注射等体积生理盐水，以模型组股骨头骨小梁稀疏中断、间隙增大为模型复制成功标准。造模成功后将大鼠随机分为6组:对照组，模型组，三七皂苷低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。大鼠体型系数折算为成人等效剂量，低、中、高剂量组分别给予5、10、20 mg/（kg·d）的三七皂苷，对照组和模型组分别给予等量生理盐水，均灌胃连续6周。于实验终点对大鼠进行采血及骨组织分离。
-
1.2.2 大鼠骨密度、骨生物力学检测
-
将大鼠麻醉后，通过X线骨密度仪检测股骨及脊柱骨密度；将大鼠处死后，分离其右侧股骨，剥离肌肉组织，用生理盐水冲洗后保存。应用万能材料试验机进行股骨三点弯曲试验：将冻存的右股骨自然解冻后置于生物力学万能试验机上，参数设置为跨距14 mm，加载速度10 mm/min，实验过程中记录各组大鼠骨载荷变形曲线、最大载荷和弹性模量。
-
1.2.3 ELISA检测
-
大鼠经腹腔麻醉后，眼眶采血1 mL，4℃ 3000 r/min离心15 min，分离血清并分装到EP管中，严格按照ELISA试剂盒说明检测血清TRAP、U-NTX、BALP、E2、U-CTX和BGP表达水平，每个样本3个重复，于450 nm波长处测量各样本吸光度值。
-
1.2.4 qPCR检测股骨骨组织中Wnt5a和c-Myc表达
-
将股骨组织样本在液氮中研磨，Trizol法提取总RNA，严格按照盒逆转录试剂盒进行逆转录，95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s，40个循环，以β-actin为内参，用2－△△Ct法计算Wnt5a和c-Myc相对表达量，引物序列见表1。
-
1.2.5 Western blot检测Wnt5a和c-Myc蛋白表达水平
-
取适量骨组织在液氮中研磨并取总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，采用5×SDS的蛋白上样缓冲液在98℃上煮沸10 min后，储存于-80℃冰箱备用。实验时将各样本加入不同的泳道，加入特异性一抗Wnt5a（1︰1 000，ab179824）、c-Myc（1︰1 000，ab32072）和β-actin（1︰2 000，ab8227）于4℃冰箱过夜。采用ECL化学发光液曝光显影，使用ChemiDoc Western blot凝胶成像分析系统进行蛋白质成像及定量分析。
-
1.3 统计学处理
-
采用SPSS23.0软件进行统计学分析。计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
-
2 结果
-
2.1 各组大鼠股骨与脊柱骨密度比较
-
通过CT证实大鼠造模成（图1）。与对照组大鼠比较，模型组大鼠股骨与脊柱骨密度均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，及三七皂苷低中高剂量组大鼠股骨骨密度和脊柱骨密度均升高，且具有一定的剂量效应，但仍低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。
-
图1 CT检查证实造模成功
-
图2 各组大鼠股骨与脊柱骨密度比较
-
2.2 各组大鼠骨组织形态学比较
-
与对照组大鼠比较，模型组大鼠皮质骨面积百分比、骨小梁平均厚度、骨小梁面积和骨小梁体积均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，活血通脉胶囊组、三七皂苷低中高剂量组大鼠皮质骨面积百分比、骨小梁平均厚度、骨小梁面积和骨小梁体积均显著增加，但仍低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
-
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
-
2.3 各组大鼠股骨生物力学指标比较
-
与对照组大鼠比较，模型组大鼠股骨弹性模量、最大载荷、断裂点载荷均显著降低（P<0.05）。与模型组大鼠比较，不同剂量三七皂苷组大鼠弹性模量、最大载荷值与断裂点载荷均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。
-
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
-
2.4 各组大鼠血清骨代谢因子表达水平比较
-
与对照组大鼠比较，模型组大鼠BALP、E2表达水平显著降低，BGP、TRAP、U-NTX和U-CTX表达水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，活血通脉胶囊组、不同剂量三七皂苷组大鼠BALP、E2表达水平显著升高，BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。
-
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
-
2.5 各组大鼠骨组织Wnt5a和β-catenin信号通路分子表达比较
-
与对照组比较，模型组Wnt5a和β-catenin mRNA和蛋白表达水平显著降低，免疫组化染色水平降低（P<0.05），与模型组比较，活血通脉胶囊组、不同剂量三七皂苷组大鼠Wnt5a和β-catenin mRNA和蛋白表达水平显著上升，免疫组化染色水平升高（P<0.01），见表5，图3，表6。
-
3 讨论
-
3.1 股骨头坏死的机制
-
股骨头坏死是一个病理演变过程，初始发生在股骨头的负重区，应力作用下坏死骨骨小梁结构发生损伤即显微骨折以及随后针对损伤骨组织的修复过程。临床最常见的诱发原因为激素长期使用引起的骨坏死，导致再生修复能力障碍[11-13]。三七皂苷R1来源于三七的干燥根及根茎，具有散瘀止血、消肿定痛、抑制血小板聚集和增加脑血流量的作用[14-15]。三七总皂苷可以上调富血小板血浆释放生长因子的浓度、促进兔骨缺损愈合[16]，三七总皂苷能抑制骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡 [17]。但三七皂苷对雌激素性股骨头坏死的作用稍有描述，相关药物的作用机制尚不清晰。
-
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
-
图3 免疫组化检测Wnt5a和β-catenin表达水平
-
3.2 三七皂苷对大鼠股骨头坏死的治疗作用
-
本研究通过建立雌激素大鼠股骨头坏死模型，并给与不同剂量三七皂苷与以治疗，发现三七皂苷不同浓度处理后大鼠椎体骨组织和股骨中骨小梁的厚度、使骨组织中骨小梁数量增加，提示了三七皂苷具有一定促进骨组织重建的作用，并且在低剂量时就具有显著的保护作用。骨生物力学是骨量和骨结构的强度的反映指标，通过机械试验的方法来测量骨骼的强度和刚度，可以直接反映出骨组织的抗骨折能力[18]。本研究结果表明不同剂量三七皂苷均对大鼠股骨的最大载荷、弹性模量和断裂点载荷均有显著的促进作用，提示三七皂苷低剂量时即可以改善骨骼的强度和韧性，对股骨头坏死的治疗具有良好的效果。
-
3.3 三七皂苷对大鼠股骨头坏死的分子机制
-
BALP、E2、U-NTX、U-CTX等检测指标是骨重建和骨破坏的重要指标[19]。本研究提示三七皂苷均能显著促进成骨相关分子BALP、E2的表达，抑制BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX等破骨相关分子的表达，显著改善大鼠股骨头坏死的症状，这种改善作用在低剂量三七皂苷时即可以发挥显著作用，并且具有显著的剂量依赖效应。Wnt/β-catenin通路在骨代谢中的作用机制在骨代谢疾病提供了治疗靶点和研究方向。研究表明由WNT/β-catenin信号参与调控股骨头坏死、骨关节炎、类风湿性关节炎等疾病，β-catenin 信号在间充质干细胞MSCs中促进成骨细胞分化，抑制软骨细胞分化，并增强软骨内成骨。例如， Wnts 的共同受体LRP6在巢蛋白表达的细胞中缺失导致骨量减少。并血清WNT和β-catenin表达在股骨头坏死不同阶段不同，可以作为鉴定股骨头坏死的生物标志物[20]。本研究发现：不同剂量的三七皂苷显著增加Wnt5a和c-MYC分子的mRNA和蛋白表达水平，提示出三七皂苷可能是通过调控Wnt5a/β-catenin信号通路发挥骨重建的作用的。
-
综上所述，本研究证实了三七皂苷可以发挥雌激素性骨头坏死大鼠的骨保护作用，其机制与Wnt5a/β-catenin信号通路分子的表达有关。
-
参考文献
-
[1] Martin CS,Cooper MS,Hardy RS.Endogenous glucocorticoid metabolism in bone:friend or foe[J].Front Endocrinol(Lausanne),2021,12:733611.
-
[2] Song MS,Yu X,Rong PZ,et al.Progress of parathyroid hormone regulating bone metabolism via different signaling pathways[J].Zhongguo Gu Shang,2021,34(6):584-588.
-
[3] Chen TH,Wang Y,Hao ZW,et al.Parathyroid hormone and its related peptides in bone metabolism [J].Biochem Pharmacol,2021,192:114669.
-
[4] Hines JT,Jo WL,Cui Q,et al.Osteonecrosis of the femoral head:an updated review of ARCO on pathogenesis,staging and treatment[J].J Korean Med Sci,2021,36(24):e177.
-
[5] Huang Z,Wang Q,Zhang T,et al.Hyper-activated platelet lysates prevent glucocorticoid-associated femoral head necrosis by regulating autophagy[J].Biomed Pharmacother,2021,139:111711.
-
[6] Li X,Lin H,Zhang X,et al.Notoginsenoside R1 attenuates oxidative stress-induced osteoblast dysfunction through JNK signalling pathway[J].J Cell Mol Med,2021,25(24):11278-11289.
-
[7] Hu YQ,Wu L,Jiang LF,et al.Notoginsenoside R2 reduces Aβ25-35-induced neuronal apoptosis and inflammation via miR-27a/SOX8/β-catenin axis[J].Hum Exp Toxicol,2021,40(12_suppl):S347-S358.
-
[8] Tang K,Su W,Huang C,et al.Notoginsenoside R1 suppresses inflammatory response and the pyroptosis of nucleus pulposus cells via inactivating NF-κB/NLRP3 pathways[J].Int Immunopharmacol,2021,101(pt b):107866.
-
[9] Liu H,Yang J,Yang W,et al.Focus on notoginsenoside R1 in metabolism and prevention against human diseases[J].Drug Des Devel Ther,2020,14:551-565.
-
[10] Yan X,Han C,Zhu Z,et al.MiR-206 promotes avascular necrosis of femoral head through Wnt signaling pathway[J].Minerva Med,2020,111(4):375-377.
-
[11] Zhou P,Xie W,Meng X,et al.Notoginsenoside R1 ameliorates diabetic retinopathy through PINK1-dependent activation of mitophagy[J].Cells,2019,8(3):E213.
-
[12] Hua KC,Yang XG,Feng JT,et al.The efficacy and safety of core decompression for the treatment of femoral head necrosis:a systematic review and meta-analysis[J].J Orthop Surg Res,2019,14(1):306.
-
[13] Cohen-Rosenblum A,Cui Q.Osteonecrosis of the femoral head[J].Orthop Clin North Am,2019,50(2):139-149.
-
[14] Patoli D,Mignotte F,Deckert V,et al.Inhibition of mitophagy drives macrophage activation and antibacterial defense during sepsis[J].J Clin Invest,2020,130(11):5858-5874.
-
[15] Zhang Y,Zhao Y,Ran Y,et al.Notoginsenoside R1 attenuates sevoflurane-induced neurotoxicity[J].Transl Neurosci,2020,11(1):215-226.
-
[16] 李世杰,马立琼,熊贤梅,等.三七总皂对富血小板血浆促进兔骨缺损愈合的影响[J].中国组织工程研究,2022,26(14):2155-2160.
-
[17] 陈伟达,石玮,杨继国,等.三七总皂苷经miR-24靶向C-myc对骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡与增殖的影响[J].浙江中西医结合杂志,2021,31(4):319-323.
-
[18] Gebhardt-Henrich SG,Pfulg A,Fröhlich EKF,et al.Limited associations between keel bone damage and bone properties measured with computer tomography,three-point bending test,and analysis of minerals in Swiss laying hens[J].Front Vet Sci,2017,4:128.
-
[19] Nizet A,Cavalier E,Stenvinkel P,et al.Bone alkaline phosphatase:an important biomarker in chronic kidney disease-mineral and bone disorder[J].Clin Chim Acta,2020,501:198-206.
-
[20] Huang J,Zhou Y,Xiao W,et al.Serum β-catenin changes vary among different stages of osteonecrosis of the femoral head:an exploratory biomarker study[J].BMC Musculoskelet Disord,2022,23(1):434.
-
摘要
目的：探究不同剂量三七皂苷对激素性股骨头坏死模型大鼠骨力学参数的影响及对Wnt/β-catenin信号通路分子的干预作用。方法：50只SD大鼠分为对照组、模型组、三七皂苷低剂量组、三七皂苷中剂量组和三七皂苷高剂量组，每组10只，采用20 mg/(kg·d)甲基强的松龙诱导激素性股骨头坏死大鼠模型, 每周注射3次，连续注射3周，对照组注射等量生理盐水。造模成功后，三七皂苷低、中、高剂量分别给予5、10、20 mg/(kg·d)剂量的三七皂苷灌胃6周，对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。实验终点检测大鼠骨密度、骨生物力学指标，骨形态学指标；通过ELISA法检测各组大鼠血清中抗酒石酸碱性磷酸酶（TRAP）、尿I型胶原交联N末端肽（U-NTX）、骨碱性磷酸酶（BALP）、雌二醇（E2）、尿型胶原交联C末端肽（U-CTX）、骨钙蛋白（BGP）等骨转化指标；通过qPCR、Western blot法及免疫组化检测骨组织中Wnt/β-catenin信号通路关键分子Wnt5a和c-Myc的mRNA和蛋白表达水平。结果：三七皂苷能显著增加股骨头坏死大鼠股骨、脊柱骨的骨密度，提高股骨生物力学参数水平（P＜0.01）；增加皮质骨面积百分比、骨小梁平均厚度、骨小梁面积、骨小梁体积（P＜0.01），增高血清中的BALP、E2水平（P＜0.01），降低血清中的BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX水平（P＜0.01）；显著增加Wnt5a和c-Myc的mRNA和蛋白表达水平（P＜0.01）。结论：三七皂苷可以提高雌激素性股骨头坏死大鼠骨力学参数，并且调控Wnt5a和c-Myc的表达，有利于雌激素性股骨头坏死的治疗。
Abstract
Objective To explore the effects of different doses of Panax notoginseng saponins on bone mechanical parameters and Wnt/β-catenin signal pathway molecules in rats with steroid induced femoral head necrosis. Methods 50 SD rats were divided into control group, model group, low dose notoginsenoside group, medium dose notoginsenoside group and high dose notoginsenoside group. The rat model of steroid induced femoral head necrosis was induced by 20 mg/(kg·d) methylprednisolone. It was injected 3 times a week for 3 weeks, and the control group was injected with the same amount of normal saline. After successful modeling, each treatment group was given 5, 10, 20 mg/(kg·d) doses of Panax notoginseng saponin by gavage for 6 weeks, and the control group and model group were given the same amount of normal saline by gavage. The bone mineral density, bone biomechanical indexes and bone morphological indexes were measured at the end of the experiment;Serum tartrate resistant acid-base phosphatase (TRAP), urinary type I collagen cross-linked N-terminal peptide (U-NTX), bone alkaline phosphatase (BALP), estradiol (E2), urinary type collagen cross-linked C-terminal peptide (U-CTX), osteocalcin (BGP) and other bone transformation indicators were detected by ELISA; The mRNA and protein expression levels of Wnt5a and c-Myc of Wnt/ β-catenin pathway molecules in bone tissue were detected by qPCR, Western blot and immunohistochemistry. Results Panax notoginseng saponins can significantly increase the bone mineral density of femur and spine in osteoporosis rats, and improve the level of biomechanical parameters of femur (P < 0.01); The percentage of cortical bone area, average trabecular thickness, trabecular area and trabecular volume were increased (P < 0.01), the levels of BALP and E2 in serum were increased, and the levels of BGP, TRAP, U-NTX and U-CTX in serum were decreased (P < 0.01); The mRNA and protein expression levels of Wnt5a/ β-catenin pathway molecules were significantly increased (P < 0.01). Conclusion Panax notoginseng saponins can improve the bone mechanical parameters of rats with estrogen induced femoral head necrosis and regulate the expression of Wnt5a and c-Myc, which is conducive to the treatment of estrogen induced femoral head necrosis.
