游离真皮脂肪移植（free dermal fat graft，FDFG）在整形外科中常用于矫正外形缺陷且被证明有效^[1-2]，如治疗由衰老、创伤、感染、肿瘤和出生引起的头颈部外形缺陷^[3]。2007年，Kijima等^[4]首次尝试对7例保乳术后患者使用下腹部的FDFG进行容量替代修复乳房缺损，结果显示FDFG美容效果良好，手术简单且安全。但实验及临床均发现移植后的真皮脂肪会出现不同程度的萎缩，继而带来体积的损失。而关于保乳术后FDFG后皮瓣存活情况以及延缓FDFG萎缩的研究极少。中药黄芪和川芎嗪具有益气活血的作用，在促进皮瓣存活和血管生成方面具有良好的应用前景，因此本研究旨在探究中药黄芪联合川芎嗪在减少游离真皮脂肪瓣体积损失的作用及其机理，探索合理的辅助用药。

1 材料与方法

1.1 实验动物

80 只雌性SD大鼠由上海西普尔比凯实验动物有限公司提供，体质量（500±50）g，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，动物合格证号：SCXK（浙）2013—0184。

1.2 实验药品及试剂材料

黄芪注射液，主要成分为黄芪，珍宝岛药业股份有限公司（国药准字：Z23020862，规格：每支装20 mL，相当于原药材40 g）；川芎嗪注射液，主要成分为川芎嗪，哈尔滨三联药业有限公司（国药准字：H20041175，规格：80 mg/支）；丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，均购自南京建成生物工程有限公司；双辛酸测定定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物FDFG移植^[5]

将80只大鼠自腹腔注射水合氯醛麻醉后，先侧卧位，侧腹部备皮，标记4 cm去皮区（图1A）。消毒后，用刀片去表皮，并切开皮下组织完整切取游离真皮脂肪组织，将其修剪至10 mm的厚度（图1B）。将取下的皮瓣修剪成2个直径2 cm的FDFG移植物。侧腹部切口止血后直接缝合关闭切口（图1C）。仰卧位，胸部备皮消毒后，切开皮下组织，分离皮瓣包括胸大肌筋膜，暴露胸大肌表面，在每只大鼠的两侧胸大肌表面移植两个2 cm的FDFG皮瓣，将所有FDFG倒扣在胸大肌表面，4周后用可吸收线缝合固定妥当，使真皮面与胸大肌紧贴（图1D-F）。

1.3.2 分组

将进行FDFG手术的80只大鼠随机分为4组，每组20只。对照组：按6 mL/kg大鼠体质量每天腹腔注射生理盐水；黄芪注射液组：按6 mL/kg大鼠体质量每天腹腔注射黄芪注射液（2 g/mL）; 川芎嗪注射液组：按6 mL/kg大鼠体质量每天腹腔注射川芎嗪注射液（2.4 mg/mL）; 黄芪+川芎嗪组：按6 mL/kg大鼠体质量每天腹腔注射含有黄芪注射液和川芎嗪注射液1:1的混合液。干预时间为4周。在FDFG手术并给药后0周（当日）、1周、2周和4周，每组各取5只大鼠用水合氯醛麻醉处死，取出游离真皮脂肪组织，称重并测量其厚度。随后用10%的福尔马林固定一小块游离的真皮脂肪组织，其余的游离真皮脂肪组织储存于-80℃。所有实验程序得到了该机构动物伦理委员会的授权（许可号IACUC-20191125-09）。

1.3.3 生物化学分析

根据南京建城生物工程研究所的说明书测定游离真皮脂肪组织中的MDA浓度、SOD活性和GSH-Px活性。

1.3.4 免疫组化分析

在第0、1、2、4周对游离的真皮脂肪组织进行免疫组化染色，以评估FDFG后脂肪组织的血管生成和细胞凋亡情况。

1.3.5 蛋白免疫印迹（Western blotting）分析

用预冷裂解液从游离的真皮脂肪组织中提取总蛋白，用双辛酸测定定量试剂盒测定其浓度。蛋白质变性后，用SDS-PAGE进行分离，然后将其转移到PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶封锁膜，然后用适当稀释比例的β-actin、CD34和血管内皮生长因子（VEGF）的一抗在4℃下孵育过夜。然后将二抗涂在膜上，再孵育1 h。最后使用凝胶成像分析设备拍摄照片。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 6.0进行绘图和统计分析。计量资料以$\stackrel{-}{x}\pm s$表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用Tukey's检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 川芎嗪和黄芪可减轻FDFG后游离真皮脂肪的萎缩

在经过FDFG之后，对照组、黄芪组、川芎嗪组和黄芪川芎嗪联合组的游离真皮脂肪重量分别由初始时的（5.077±0.169）g、（5.053±0.128）g、（5.047±0.200）g和（5.059±0.098）g下降至第4周的（4.012±0.058）g、（4.183±0.103）g、（4.229±0.047）g和（4.276±0.081）g；游离真皮脂肪厚度分别由初始时的（10.52±0.34）mm、（10.67±0.69）mm、（10.50±0.72）mm和（10.65±0.53）mm下降至第4周的（4.012±0.122）mm、（4.308±0.097）mm、（4.328±0.061）mm和（4.405±0.012）mm。但在实验的第4周，游离真皮脂肪的质量和厚度都保持在较高水平，表明FDFG大鼠模型构建成功（图2A、2B）。

在第4周，川芎嗪组、黄芪组和黄芪川芎嗪联合组的游离真皮脂肪重量及厚度明显高于对照组（P ˂0.05，图2C、2D）。在所有组别中，黄芪川芎嗪联合组的皮瓣最重、最厚。

2.2 川芎嗪和黄芪可减轻FDFG后游离真皮脂肪的损伤

川芎嗪组和黄芪川芎嗪联合组的SOD活性在第1、2、4周显著高于对照组（P˂0.05）。黄芪组在第4周的SOD活性明显高于对照组（P=0.027）。所有给药组在第1周和第4周的GSH-Px活性明显高于对照组。与对照组相比，给药组在第1、2、4周的MDA含量更低，见图3。

2.3 川芎嗪和黄芪增加FDFG后游离真皮脂肪中VEGF和CD34的表达

在第0周，4组的VEGF阳性细胞面积无明显差异。而黄芪组和黄芪联合川芎嗪组在第1周和第2周的VEGF阳性细胞面积明显高于对照组。第4周，所有给药组的VEGF阳性细胞明显多于对照组（P˂0.05），且黄芪联合川芎嗪组也明显高于黄芪组和川芎嗪组（P˂0.001，图4）。

在第1、2和4周，所有给药组的CD34阳性细胞数量都高于对照组，尤其是黄芪联合川芎嗪组，在第2周和第4周差异更明显。此外，黄芪联合川芎嗪组CD34阳性细胞数量也明显高于黄芪组（P˂0.05，图5）。

2.4 川芎嗪和黄芪增加FDFG后游离真皮脂肪中VEGF和CD34的蛋白表达

Western blotting结果显示，4组的VEGF和CD34蛋白表达在第0周无明显差异。第4周，与对照组相比，所有给药组的VEGF和CD34的蛋白表达都有所增加，与免疫组化的结果一致，见图6。

3 讨论

自体FDFG是整形外科中修复头面部缺陷组织的成熟技术，其简单实用，风险低，可操作性强^[1-3]。国外一项临床研究证明，使用腹部真皮脂肪移植能重塑较大且自然的臀部和持久的美学效果^[6]。近年来它也越来越多地被应用于乳房整形手术。目前，FDFG移植物在乳房修复上主要应用于保乳术后修复，优点在于扩大了保乳适应症及避免了创伤更大的乳房重建术。而切除腺体质量、FDFG 大小及重量是术后并发症发生的风险因素^[7]。但关于保乳术后FDFG皮瓣存活情况以及如何延缓FDFG萎缩的研究极少。

本研究发现将SD大鼠腹部的游离真皮脂肪组织移植到胸部后，4周内各组的FDFG都保持在一定的重量和厚度范围内，所有手术组均看到新生血管代表皮瓣成活，这说明使用FDFG来保持乳房的完整和美观是可行的。但是，对照组第4周游离真皮脂肪组织的重量与初始重量相比下降了约20%，说明FDFG手术后一段时间内游离真皮脂肪组织会出现不同程度的萎缩。Kijima等^[4]发现，在皮瓣植入后的几周内均会出现不可逆转的部分移植物体积损失。因此，探索一种减少FDFG体积损失的方法对乳房重建维持外观至关重要。

中药黄芪有养气活血的作用^[8-9]。据报道，黄芪的总皂苷对血管内皮损伤有明显的保护作用^[10-11]，且可以通过抑制炎症细胞因子的表达促进组织修复^[12]。川芎嗪在中国被广泛用作血管扩张剂^[13]。研究发现，川芎嗪通过刺激血管内皮生长因子的表达和保护肾小管间质中的微血管来保护肾脏^[14]。

SOD具有抗氧化和抗衰老作用，其机制主要是清除有害的超氧阴离子自由基。有研究发现，黄芪可以降低TNF、MDA的含量、增加肠道中SOD的活性，以减少肠道黏膜的损伤^[15]。GSH-Px是广泛存在于体内的一种重要过氧化物酶，能保护细胞膜的结构和功能不受氧化剂的干扰和破坏。有研究报道，SD大鼠肝移植后的肝脏损伤程度与GSH-Px的活性有反向关系^[16]。因此，认为SOD和GSH-Px活性都对组织损伤起着重要的保护作用。有研究认为从黄芪中提取的异黄酮可能通过保护细胞内抗氧化酶的活性和增强内源性抗氧化功能来降低高葡萄糖水平所引起的氧化损伤水平^[17]。而在本研究中，发现所有给药组增加了SOD和GSH-Px的活性，表明黄芪和川芎嗪对FDFG中抗氧自由基介导的缺血再灌注损伤具有保护作用。MDA是脂质过氧化的主要代谢物。在这项研究中，黄芪注射液、川芎嗪注射液以及黄芪和川芎嗪混合注射液降低了移植后游离真皮脂肪中MDA的含量，这可能会减轻游离真皮脂肪组织的损害。

VEGF可促进血管通透性、细胞外基质降解、血管内皮细胞迁移、增殖和血管生成。动物实验研究表明，血管生成因子（包括VEGF）可以使游离脂肪移植后的移植物血管再生^[18]。CD34是一种I型跨膜糖蛋白，在促进细胞间黏附方面发挥着重要功能，它可以通过促进血管和脂肪细胞的生长来提高脂肪移植的存活率^[19]。本研究免疫组化和蛋白结果都显示，与对照组相比，给药组都增加了VEGF和CD34的表达，表明黄芪注射液、川芎嗪注射液及黄芪和川芎嗪混合注射液均促进了FDFG新生血管的生成。

综上所述，黄芪注射液、川芎嗪注射液及黄芪联合川芎嗪混合注射液可能是通过减少移植之后的游离真皮脂肪组织的氧化损伤，促进脂肪组织中新血管的生成、脂肪细胞的生长，从而达到延缓游离真皮脂肪厚度和重量的减少的效果。本研究证明中药黄芪联合川芎嗪具有提高缺血皮瓣成活以及维持移植物体积的潜力，二者联合应用疗效最佳。

参考文献