重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是普通外科较为常见的、严重的急症之一，具有起病急、病情重、死亡率高的特点，常导致多器官衰竭^[1]。急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）约有20%发展为SAP，其病死率约30%^[2]。尽管目前AP治疗有很大改善，但SAP病死率仍然很高。炎症反应在SAP的发生发展中起关键作用^[3]。核因子-кB是重要的转录调节因子，它对炎症因子的调节着非常重要的作用。自噬对维持细胞内成分的稳态起重要作用，自噬功能受损可导致多种疾病的发生^[4]。自噬的标志物为蛋白轻链3（ light chain 3Ⅱ，LC3-II）、自噬相关蛋白p62、溶酶体相关膜蛋白2（lysosome associated membrane protein，LAMP2），通过对其进行研究就可以评价自噬功能。研究证实，自噬功能受损会导致胰酶的激活，在AP的发生发展中起重要作用^[5]。连翘是我国常用的一种中草药，近年来，连翘的抗炎机制及其主要成分一直是目前中医药研究的热点^[6]。但目前连翘治疗SAP及与细胞自噬的相关研究还较少。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯是一种核因子-кB抑制剂，其可抑制炎症因子的释放，从而减轻SAP^[7]。本研究旨在探讨连翘对重症急性胰腺炎时炎症因子和细胞自噬的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD雄性大鼠36只，体质量（200±50）g，购自山西医科大学动物中心。

1.2 主要试剂及仪器

牛磺胆酸钠（NaTC）、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯均购自山西赛奥生物科技有限公司，血淀粉酶试剂盒、肿瘤坏死因子（TNF）-α试剂盒、白细胞介素（IL）-1β试剂盒均购自睿信生物，抗兔P62、抗兔LAMP2及抗兔 LC3均购自博奥森生物科技有限公司。

1.3 实验动物分组及造模

将36只大鼠随机分为对照组、SAP组及连翘干预组。其中连翘干预组又分为连翘高浓度（AFS1）、连翘中浓度（AFS2）、连翘低浓度（AFS3）三组（分别对应5 g/kg、2.5 g/kg、1.25 g/kg共3个浓度）及阳性对照组（给予吡咯烷二硫代氨基甲酸酯），每组6只，在造模前1周，给AFS1、AFS2、AFS3组开始给药，1次/d，灌胃。造模前大鼠禁食12 h，在造模前1 h，阳性对照组大鼠给予吡咯烷二硫代氨基甲酸酯100 mg/kg腹腔内注射。SAP组及连翘干预组大鼠使用1％戊巴比妥钠（0.4 mL/kg）进行腹腔内注射麻醉，待其麻醉后固定于清洁台上消毒、铺单。经腹壁正中切约2 cm切口，找到十二指肠，在其内侧及胃的内侧可看到粉红色的胰腺组织，将肝脏用镊子挑起，找到肝总管，用动脉铗暂时夹闭肝总管，提起十二指肠，可见一透亮管性结构，其为胰胆管，用5.5号静脉针斜行刺入胰胆管，用动脉夹固定针头，连接1毫升注射器，缓慢将5％牛磺胆酸钠（0.1 mL/100g）推入，注射结束后停留2~3 min，见胰腺充血水肿后拔出针及动脉铗，查无胆漏，关闭腹部切口。SO组与SAP组及连翘干预组采用相同手术方式，仅翻动内脏，但不注射药物。

1.4 连翘水煎液的制备

取连翘药材200 g，每次煎2 h，一共煎制2次，过滤，浓缩，定容至80 mL^[8]，过滤后质量浓度成为25 g/mL，放4℃冰箱备用。

1.5 实验标本留取

12 h后将大鼠处死，经腹主动脉取血，经抗凝处理后，立即离心，分离后放置-20℃冰箱保存，将胰腺组织分为3部分，一部分甲醛固定，石蜡包埋；一部分组织2.5%戊二醛固定液固定，置于4℃冰箱；剩余胰腺组织置于-80℃冰箱冻存。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 血淀粉酶（serum amylase，AMY）、TNF-α、IL-1β的检测

按照试剂盒制造商的操作说明检测。

1.6.2 胰腺组织病理观察及评分

包埋处理的胰腺组织：部分胰腺组织行苏木素-伊红染色法（HE）染色切片，镜下观察，并使用Schmidt法评分，随机留取10个高倍视野，最后取平均分；部分胰腺组织使用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）法检测P62、LC3II、LAMP2的表达，随机留取6个高表达视野，最后图片使用Image Pro Plus软件测量出相对应的累计光密度值及区域面积值，然后计算出平均光密度值表示结果。

1.7 统计学处理

数据使用SPSS26.0软件进行分析，计量资料以$\stackrel{-}{x}\pm s$表示，组间比较使用单因素方差分析，多重比较用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清AMY、TNF-α、IL-1β水平比较

SAP组AMY、TNF-α、IL-1β较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；连翘干预组及阳性对照组的AMY、TNF-α、IL-1β较SAP组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 胰腺病理变化及评分

胰腺组织HE染色后于高倍镜（400倍）视野下对照组胰腺正常，SAP组胰腺外分泌腺明显肿胀，腺体细胞出现弥漫性空泡样改变，大量坏死灶，大量炎细胞浸润。AFS1组未见明显腺泡水肿和坏死，偶见炎细胞浸润，脂肪组织可见出血，无坏死，AFS2、AFS3组及阳性对照组均可见胰腺水肿，无坏死，可见炎细胞浸润（图1）。胰腺标本病理观察及评分显示，连翘干预组和阳性对照组胰腺病理评分明显低于SAP组，差异有统计学意义（表2）。

注：^a与对照组比较，P<0.05；^b与SAP组比较，P<0.05

注：^a与对照组比较，P<0.05；^b与SAP组比较，P<0.05

2.3 各组大鼠胰腺组织P62、LC3II、LAMP2表达水平比较

与对照组相比，SAP组LC-3II、P62的表达均增加，但LAMP2表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05，表3、图2）；与SAP组相比，连翘干预组LC-3II、LAMP2的表达均增加，但P62表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05，表3、图2）。

注：^a与对照组比较，P<0.05；^b与SAP组比较，P<0.05

3 讨论

重症急性胰腺炎在临床属于急危重症，随着病情的发展，常常会引起全身炎症反应综合（systemic inflammation response syndrome，SIRS）和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），进而危及生命。目前临床治疗SAP仍以补液、抗感染、抑酶等对症支持治疗为主，但是患者死亡率依旧较高，患者治疗预后较差。AP的一个非常重要的特征就是炎症反应，TNF-α、IL-1β均为SAP时常用的炎症细胞因子，其在正常人体含量较低甚至没有，但在SAP时，其表达急剧上升，促进疾病的发生发展^[9]，而连翘作为我国常见的一味中药，其具有抗病毒、抗炎、保肝等多种病理作用^[10]，目前对于连翘治疗SAP的研究还比较少，本研究发现，在SAP大鼠模型中使用连翘干预后，血清AMY、TNF-α、IL-1β的表达比SAP组明显降低，胰腺组织的病理评分也明显降低，说明连翘可将低SAP的炎症反应，减轻胰腺的损伤，这为连翘治疗SAP又提供了一份可靠的依据。

SAP中腺泡细胞的损伤与炎症、自噬等密切相关^[11]。多项研究表明，自噬功能异常是促使AP进展的重要因素，通过对自噬相关因子主要包括自噬标志物LC3-II、自噬降解底物P62蛋白、LAMP2的研究，就可以评价自噬的功能，进而探讨二者的关系。LC3-II存在于胰腺腺泡细胞的自噬体，其是吞噬泡闭合的必要条件^[12]，因此通过检测LC3II，可以评价自噬体的生成数量。P62是自噬降解物质时重要的底物蛋白，胰腺炎时P62增加，证明了自噬功能可能受到损害^[13]。因此通过对P62的检测，可以评价自噬功能；LAMP-2在调节自噬溶酶体的形成过程中起主要作用。有研究发现敲除LAMP-2基因可导致自噬受损，使腺泡细胞内酶原颗粒降解受限，胰蛋白酶原异常激活，从而加重AP^[14]。因此，检测LAMP-2的水平可以评价自噬的活性。通过我们的实验研究发现，SAP大鼠胰腺组织内LC3II与P62表达同步增加，但LAMP2的表达减少，说明SAP时自噬功能受损，而在使用连翘干预后，发现LC3II与LAMP2表达增加，但P62的表达减少，说明自噬的功能得以恢复，阳性对照药使用吡咯烷二硫代氨基甲酸酯，其是核因子-кB的抑制剂，因此猜测连翘对自噬的影响可能通过核因子-кB信号通路来发挥作用。

AP的一个非常重要的特征就是炎症反应，其常常在AP的病情变化上起决定性作用。自噬与炎症反应之间存在的密切的联系，自噬在调节炎症反应（细胞因子）方面起重要作用，有研究发现，正常自噬能够抑制IL-1β、TNF-α等炎症因子的产生^[15]。也有研究发现，TNF-α、IL-1β等能够诱导自噬的产生^[16]。然而自噬功能受损也可促进炎症反应，如细胞中自噬功能受损，将会导致P62的堆积，从而激活核因子-кB^[17]，产生大量的促炎因子，如TNF-α、IL-1β等^[18]，从而导致炎症反应加重。本实验也观察到，SAP大鼠TNF-α、IL-1β的水平较对照组明显增加，而且自噬功能也受损，考虑SAP时，大量促炎因子致自噬的功能受损，不能及时清除腺泡细胞内被激活的胰蛋白酶，同时，抑炎因子的滞后，不能及时中和促炎因子，结局就是促炎因子的持续积累，对自噬的抑制作用更强烈，且炎症反应的持续扩大化，更多的胰酶被激活、释放，加重对胰腺组织的损害。而在连翘干预后，抑制了核因子-кB活性^[19]，致使TNF-α、IL-1β等促炎因子释放减少，使自噬功能得以恢复，从而减轻了SAP。

总之，SAP时将会导致自噬功能的受损，其可能与炎症因子的大量释放有关，而在连翘干预后，炎症因子TNF-α、IL-1β明显减少，AFS1、AFS2、AFS3呈量效关系，其中AFS3组与阳性对照组对比无显著性差异，阳性对照药使用吡咯烷二硫代氨基甲酸酯，其是核因子-кB的抑制剂，因此考虑连翘主要通过核因子-кB通路来发挥作用，其抑制了核因子-кB活性，使促炎因子释放减少，从而使受损自噬功能得以恢复，最终缓解SAP。

参考文献