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糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的常见并发症之一，全球每年有910万~2 610万DM患者发生DFU，19%~34%的糖尿病患者会受到影响[1-2]，而患有DFU患者5年内死亡风险是没有足部溃疡的DM患者的2.5倍[3]，其高发病率、高死亡率为人类健康带来了巨大威胁。尽管DFU的治疗费用正在不断增加，甚至超过了许多常见癌症的治疗费用，但约20%的DFU患者1年内未治愈，复发率约为40%[2]，对社会经济造成沉重负担。因此预防DFU的发生与复发显得尤其关键。DFU发病机制复杂，课题组前期利用定量检测蛋白芯片技术筛选出的DFU患者与DF患者血清差异蛋白骨形态发生蛋白4（BMP-4）在高血糖及DM状态下能够通过增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生导致氧化应激（oxidative stress，OS），造成内皮细胞凋亡[4]，多项研究证实DM患者OS的过度激活进而引起的细胞凋亡与DFU及多种DM并发症的发生密切相关[5-7]。因此本文就BMP-4介导的OS与细胞凋亡在DFU发生过程中的作用进行综述，以期为预防DFU的发生与复发提供新的思路。
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1 糖尿病与氧化应激
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活性氧（reactive oxygen species，ROS）是所有需氧生物中氧代谢的天然副产物，主要类型包括超氧化物、过氧化氢自由基、单线态自由基等[8]，主要在线粒体中产生，但也被包括NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）在内的其他途径诱导[9]。正常状态下，ROS的产生会被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、过氧化氢酶等形成的抗氧化防御（antioxidant defense，AOD）系统清除，从而达到平衡[10]。但当机体处于DM等疾病状态下时，这种平衡将被打破。糖尿病患者机体长期处于高血糖状态，会导致细胞中线粒体功能障碍、AOD受到抑制，此外，高浓度的葡萄糖会激活DM中的危险代谢途径——二酰甘油（diacylglycerol，DAG）-蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）-NOX，三者均会导致ROS的产生增加[11]，这种作用在高血糖敏感细胞如内皮细胞中更为明显[9]，ROS广泛参与细胞内的多种生物学过程，其中就包括诱导内皮细胞凋亡[12-13]。当ROS产生增加、AOD系统受到干扰以及高血糖状态下晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）大量累积时，会造成OS的过度激活，过度的OS会破坏细胞DNA、脂质、蛋白质，造成细胞死亡，最终导致组织损伤，在包括DFU在内的在多种DM并发症发病机制中发挥重要作用[14-16]。因此，控制DM状态下ROS产生的增加、OS的过度激活可能是防治DFU的关键。
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2 氧化应激与细胞凋亡
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2.1 细胞凋亡
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细胞死亡是所有生物体正常生长发育的一个基本过程，通过多种机制发生，它与细胞增殖之间的动态平衡对维持细胞稳态、调节细胞代谢等有重要作用。正常状态下细胞死亡后会被吞噬细胞迅速清除，但在感染、慢性炎症或组织损伤发生时，大量细胞突然死亡并不断累积，会导致系统功能紊乱[17]。细胞凋亡首次提出于1972年[18]，是程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）的主要途径之一，其他PCD主要途径还包括坏死性凋亡和细胞焦亡[19-20]。细胞凋亡是细胞内预存的死亡程序被某种因素诱发，进而引起细胞死亡的过程，它会引起细胞皱缩、核碎裂和染色质片段化，最终形成凋亡小体。正常状态下，细胞凋亡在调节机体的生长发育和免疫反应，清除机体中多余或异常的细胞方面发挥着重要作用，是细胞维持生命活动的重要过程[21]。但多种危险因素亦可诱导细胞凋亡的发生，如细胞DNA损伤、缺氧、氧化应激及辐射等[20]。同时，细胞凋亡的发生也涉及到包括线粒体途径、内质网途径、死亡受体途径在内的多条信号通路，并且参与了多种DM并发症的发病过程[22-24]。
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2.1.1 Bcl-2家族与细胞凋亡
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自二十世纪八十年代B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）首次被发现之后，越来越多的Bcl-2家族成员被发现，它们具有一个或多个Bcl-2同源性（Bcl-2 homology，BH）结构域，并且在调节细胞凋亡的过程中发挥巨大作用[25-26]。BH结构域包括BH1-BH4，能够促进家族成员相互作用，并且Bcl-2家族成员能根据BH结构域的不同，在调节细胞凋亡时发挥促凋亡或抗凋亡功能[27-28]。Bcl-2促凋亡亚家族成员包括Bax、Bak等，能够作用于线粒体外膜（mitochondrial outer membrane，MOM），激活或形成MOM孔隙，改变线粒体外膜通透性（mitochondrial outer membrane permeability，MOMP），导致凋亡因子释放至细胞质中，造成细胞凋亡，而Bcl-2抗凋亡亚家族成员Bcl-2、Bcl-XL等能够抑制MOM孔隙形成过程，从而达到抗凋亡的作用[29-30]。由此可见，Bcl-2促凋亡、抗凋亡亚家族成员二者之间的平衡是细胞存活的关键，在DM状态时对二者动态平衡进行有效干预，可能是防治DFU的有效手段。
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2.1.2 Caspase家族与细胞凋亡
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天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶（cysteine-containing aspartate-specific protease，Caspase）家族成员主要在细胞凋亡及炎症中发挥作用[31]。根据其功能，可以将Caspase家族成员分为凋亡型及炎症型，Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11和Caspase-12等主要参与炎症的介导，而凋亡型Caspase又根据其在细胞凋亡中的功能顺序，分为凋亡启动子和凋亡效应子，凋亡启动子包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10，凋亡效应子包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，Caspase-14则与细胞分化有关[32-33]。在细胞中，Caspase通常是以无活性的酶原形式存在，细胞凋亡发生的核心过程依赖于Caspase的活化。当受到促凋亡信号刺激时，会使细胞启动Caspase级联反应，存在于凋亡启动子N端的激活和募集结构域（caspase activation and recruitment domain，CARD）募集Caspase酶原，形成具有活性的二聚体结构，然后切割活化凋亡效应子，从而引发细胞凋亡[34]。根据不同的促凋亡信号活化途径，Caspase介导的细胞凋亡又分为内源性凋亡途径和外源性凋亡途径。
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2.1.3 内源性凋亡途径
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内源性凋亡途径，又称线粒体调节途径或Bcl-2调节途径。线粒体通过多种代谢功能，在生物体各种生命活动中发挥至关重要的作用，在细胞凋亡的诱导执行过程中，线粒体也处于核心地位[35-36]。当线粒体受到促凋亡信号如氧化应激、DNA损伤刺激时，会诱导Bcl-2促凋亡亚家族成员Bax等作用于MOM，改变MOMP，导致促凋亡分子细胞色素C（cytochrome c，CytC）释放到细胞质中，与凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease-activating factor-1，Apaf-1）WD结构域结合，改变并暴露Apaf-1核苷酸结合位点，通过凋亡启动子Caspase-9的CARD与之结合，形成凋亡小体复合物，促使Caspase-9活化，进而激活凋亡效应子Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，引发细胞凋亡[37-39]。
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2.1.4 外源性细胞凋亡
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外源性细胞凋亡即死亡受体（death receptor，DR）途径细胞凋亡，DR家族包括肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor-1，TNFR1）、凋亡抗原1（apoptosis antigen 1，APO-1/Fas）、DR3、DR4等，其中Fas介导的凋亡途径最为经典[40]。在受到促凋亡信号刺激时，Fas通过其上的死亡结构域（death domain，DD）与Fas相关死亡结构域蛋白（Fas-associated death domain protein，FADD）C端的DD发生相互作用募集FADD，FADD的N端具有死亡效应结构域（death effector domain，DED），它能与凋亡启动子Caspase-8和Caspase-10前结构域中的DED发生相互作用，形成包括Fas、FADD、Caspase-8或Caspase-10在内的三元死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex，DISC），然后发生凋亡启动子的自我活化，随之将其释放到细胞质中，切割活化激活凋亡效应子启动细胞凋亡[24，41-42]。
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另外，外源性细胞凋亡能够通过Bcl-2家族成员、凋亡激活剂Bid与内源性细胞凋亡相互联系。由Fas激活的下游Caspase能够切割Bid以产生tBid，激活Bax改变MOMP，从而发生内源性细胞凋亡[43]。
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3 BMP-4
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3.1 糖尿病足与BMP-4
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本课题组前期利用定量检测蛋白芯片技术对DM患者及DFU患者血清差异蛋白进行了检测，依据表达差异基因筛选标准进行筛选，筛选出差异显著的血清蛋白29种，DFU组中21种蛋白表达上调，其中则包括BMP-4。并且对差异蛋白进行差异倍数排序、查询蛋白功能结合文献研究，挑选差异倍数高、功能与组织修复相关的8种血清差异蛋白，利用Elisa法进行了扩大样本量的验证研究，发现DM组与DFU组间BMP4差异明显，且表达趋势与蛋白芯片结果一致，可作为DFU发生的候选生物标志物。由此可见，BMP-4在DFU的发生、发展过程中具有不可忽视的作用。
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3.2 糖尿病与BMP-4
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骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，是于1965年首次从脱钙骨中提取出来的一类具有促成骨活性的蛋白质成分，目前已确认和鉴定了超过30名BMPs家族成员，且已证明BMPs与细胞形态、分化、增殖与凋亡密切相关。有研究显示，DM可诱导BMPs家族成员BMP-4在内皮细胞中的高表达，参与DM血管病变的发生过程[44-45]。BMP-4导致DM血管病变的主要机制包括以下几个方面：1）激活炎症核转录因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路，导致内皮细胞内黏附分子ICAM-1的表达和单核细胞黏附，促进炎症的发生造成内皮细胞损伤[46-48]；2）介导内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的异常表达，并导致血管舒张功能受损[49]；3）激活NADPH氧化酶以诱导ROS的产生，从而增加环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达，以促进血管内皮依赖性收缩并加重组织损伤[49-50]；4）抑制胰岛素信号传导，造成胰岛素抵抗[51]。因此，BMP-4可能通过促进炎症、介导eNOS、COX-2的异常表达造成血管损伤以及影响血糖从而参与DM并发症的发生过程。
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3.3 BMP-4介导氧化应激发生细胞凋亡
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有研究显示，在高血糖和DM条件下，BMP-4能够通过NOX1介导ROS的过度生成，且这种作用是相互的，过度生成的ROS亦会增加BMP-4的表达，形成恶性循环，引发OS造成内皮细胞凋亡及内皮功能障碍[4，52]。除了通过NOX1增加ROS的过度生成造成OS外，BMP-4触发的炎症反应导致的炎症因子的大量释放亦会刺激ROS的产生造成OS，从而导致炎症和OS之间的恶性循环，进一步造成内皮细胞凋亡、血管组织损伤[53]。因此，BMP-4介导的炎症及氧化应激是导致内皮细胞凋亡、血管组织损伤的关键。
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4 小结
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DFU因为其治疗难度大、治疗费用高等特点，对社会医疗及经济造成了重大负担，成为了亟待解决的难题。目前有关DFU的研究大多集中在治疗相关方面，预防DFU发生与复发的研究尚不多见。因此本文基于前期筛选出的DM与DFU患者血清差异蛋白BMP-4及其对DM状态下血管内皮细胞的氧化应激和细胞凋亡存在的调控作用进行了综述。
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综上所述，DM能够上调ROS导致OS，引发包括内源性细胞凋亡、外源性细胞凋亡在内的多种途径的细胞凋亡，造成血管组织损伤，最终导致DFU及多种DM并发症的发生。BMP-4在此过程中存在的调控作用主要包括以下几个方面：1）DM能够诱导BMP-4的产生，通过NADPH氧化酶NOX1刺激ROS过度生成；2）BMP-4的促炎作用导致的炎症因子的大量释放亦会刺激ROS过度生成，导致OS，形成炎症与OS之间的恶性循环；3）BMP-4与ROS之间存在的互促作用，进一步导致OS的激活。除参与DFU发病过程中细胞凋亡的调控外，BMP-4还能通过促炎、介导eNOS和COX-2的异常表达、造成胰岛素抵抗等作用造成血管内皮功能障碍及血管组织损伤。
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因此，DM状态下，高表达的BMP-4通过氧化应激介导的细胞凋亡及其他多种作用造成的血管内皮功能障碍及血管组织损伤可能是导致DFU发生的关键，对BMP-4进行早期干预、调控，能够从多个方面预防DFU的发生。
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摘要
糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病（DM）致残、致死的严重并发症之一，目前尚无有效手段预防DFU的发生。DFU发病机制复杂，DM引起的氧化应激（OS）过度激活造成的细胞凋亡、血管组织损伤是DFU及多种DM并发症发病的关键。骨形态发生蛋白4（BMP-4）是课题组前期筛选出来的DFU及DM患者血清差异蛋白，研究发现其与DFU发病过程中OS介导的内皮细胞凋亡密切相关，并且DM状态下BMP-4还具有促炎、导致内皮功能障碍等作用，均会导致DFU的发生、发展。因此靶向调节BMP-4，降低其过度表达可能是预防DFU的新策略。文章阐述了DM状态下活性氧（ROS）的过度释放等导致OS过度激活造成细胞凋亡、血管组织损伤，最终导致DFU发生的关键过程，以及BMP-4通过NADPH氧化酶（NOX1）等多种途径对其产生的调控作用。除此之外，还阐述了DM状态下，BMP-4通过激活炎症核转录因子κB（NF-κB）信号通路等多种方式导致的内皮功能障碍及血管组织损伤的过程，以期为DFU预防的相关研究提供参考方向。