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下肢血管病变作为2型糖尿病常见并发症之一，发病率高达20%，如果没有得到有效的治疗，患者将面临截肢的风险[1]。目前该病的治疗药物主要包括血管舒张药物、磷酸二酯酶抑制剂、前列腺素类药物等。然而，这些现有药物通常作用机制单一且疗效并不理想。中药制剂具有通过多种药物配伍发挥协同作用，从而达到更好疗效的特点，因此将中药制剂联合运用增强疗效是一个有效的治疗思路，同时对其治疗机制的探讨也具有十分重要的意义。
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关于糖尿病患者下肢缺血的原因，从中医角度分析主要为气虚血瘀，脉络失养。本文使用的脉管复康片和糖痹外洗方，都能够通经活络、活血化瘀，在中医角度是对证之药。现代药理学研究认为其可能的发病机制是，糖尿病患者机体持续高血糖状态以及氧化应激使内皮功能受损，导致供血障碍，动脉闭塞，发生反应性血管新生障碍等[2-3]。本研究根据其可能的发病机制，在建立大鼠糖尿病下肢缺血模型的基础上，通过检测大鼠血清中血栓素A2（TXA2）、内皮素（ET）-1、一氧化氮（NO）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管细胞黏附分子-1（sVCAM-1）、C反应蛋白（CRP）含量，免疫组化染色检测腓肠肌微血管形成情况，旨在探讨这一联合用药的疗效及作用机制。
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1 材料与方法
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1.1 实验药品
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脉管康复片（天津同仁堂集团股份有限公司；规格：0.6 g/片；国药准字：Z12020023；成分：丹参、鸡血藤、郁金、乳香、没药）；糖痹外洗方（广东省中医院临床试验用药品；规格：17.5 g/袋；生产批号：J2010003；成分：花椒、辣椒、乳香、没药、红花、忍冬藤、冰片）。
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1.2 实验动物
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50 只SPF级雄性Wistar大鼠（北京维通利华提供），实验动物生产许可证号SYXK（津）2019-0001，体质量为130~180 g。
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1.3 实验方法
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1.3.1 糖尿病下肢缺血大鼠模型的建立
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根据文献方法[4-5]，将购得的SPF级雄性Wistar大鼠适应性饲养1周，给予高脂饲料（蛋白质20%、碳水化合物35%、脂肪45%）喂养4周。禁食12 h后，腹腔注射链脲佐菌素（STZ）40 mg/kg；对照组注射缓冲液。继续高脂饲料喂养3周，选择血糖值≥16.7 mmol/L的稳定糖尿病大鼠模型，腹腔注射7%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉后固定，左下肢腹股沟处脱毛、消毒，做一个2 cm长的纵行切口，用显微镊分离动脉、静脉和神经，并结扎股动脉建立下肢缺血模型[6-7]，然后缝合皮肤并涂抹青霉素溶液。
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1.3.2 分组与给药
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取造模成功大鼠32只，随机分为模型组以及给药高、中、低剂量组，每组8只，另取8只正常大鼠作为正常对照组。其中给药组给予脉管复康片（高、中、低剂量分别为1 600、800、400 mg/kg），并联合糖痹外洗方外洗患肢（采用中医溻渍法[8]：药液浸润棉球外洗数次后，覆盖下肢，包扎固定）。经过21 d的连续给药后，取心脏血及术侧腓肠肌组织待用。模型组和空白组均不给药。
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1.3.3 各组大鼠日常状况监测
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监测并记录各组大鼠体质量、饮水量、死亡情况、健康状况及精神状况等。
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1.3.4 血清中炎性因子的检测
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根据sVCAM-1、CRP试剂盒说明书操作，将标准品梯度稀释成不同浓度，向不同浓度标准品孔、样品孔、空白孔中分别加入HRP标记的检测抗体，进行孵育、显色，终止反应后在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD）值。绘制标准曲线，并计算各待测样品中炎性因子的浓度。
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1.3.5 血清中血管内皮相关因子检测
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采用ELISA法按试剂盒说明书检测血清TXA2、ET-1、eNOS、VEGF含量。使用一步法一氧化氮测定试剂盒检测血清NO含量：按操作说明进行样品前处理后，空白孔、标准孔、测定孔分别加160 μL双蒸水、标准液、经处理的样品上清液；显色后在550 nm波长下测OD值，并计算血清中NO含量。
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1.3.6 HE染色检测
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取出大鼠腓肠肌组织，进行脱水、透明、固定等操作制备切片。二甲苯脱蜡、至水后，进行染色；染色完成后再次脱水、透明，用中性树胶封片。在显微镜下（200倍）观察肌细胞的病理学改变，采集数据并分析。
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1.3.7 免疫组化检测大鼠缺血下肢新生微血管数量
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如1.3.6所述将样本制备好组织切片；然后进行抗原修复；滴加内源性过氧化物酶阻断液；先后加入血清封闭液、一抗、二抗进行孵育后显色；复染；最后脱水、透明，再封片，即可在显微镜下观察，采集图像分析测量每张切片中不同高倍视野内（200倍）微血管数量。
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1.3.8 统计学分析
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采用GraphPad Prism软件对数据进行统计学分析，数据用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 各组大鼠一般情况
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在注射STZ溶液3～4 d后，大鼠逐渐出现多饮、多尿症状，精神状态变差，活动变少，体质量测量记录显示，大鼠体重先逐渐增长，造模后出现显著下降趋势。
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2.2 脉管复康片联合糖痹外洗方对大鼠血清中炎性因子的影响
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模型组大鼠血清中sVCAM-1、CRP水平较正常组显著升高。与模型组相比，脉管复康片高剂量组sVCAM-1水平明显降低，低、中剂量组变化不明显；脉管复康片各组CRP含量变化均不明显。见图1。
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图1 各组大鼠血清中炎性因子水平比较
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2.3 脉管复康片联合糖痹外方对大鼠血清中血管内皮相关因子的影响
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与正常组比较，模型组大鼠血清中TXA2、ET-1的含量明显增加，而eNOS、NO含量显著降低。与模型组相比，3个脉管复康片剂量组TXA2水平均显著降低；ET-1水平均有所下降，且高剂量组有显著性差异；各脉管复康片剂量组eNOS水平均显著升高；高剂量组NO的含量增加明显，其余两组仍和模型组相差不大。模型组大鼠血清VEGF含量低于正常组，与模型组相比，脉管复康片高、中剂量组VEGF水平显著升高，低剂量组无显著性差异。见图2。
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图2 脉管复康片联合糖痹外洗方对大鼠血清中血管内皮相关因子的影响
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2.4 HE染色观察腓肠肌组织形态变化
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正常组肌细胞排列整齐紧密，分界清晰，胞质丰富，细胞形态正常，而模型组部分视野可见明显水肿，肌细胞排列疏松紊乱，间隙增宽。经给药治疗后，缺血部位视野中未见明显细胞萎缩坏死。见图3。
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2.5 脉管复康片联合糖痹外洗方对大鼠缺血下肢血管新生的影响
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正常组微血管平均数量为每视野下7.2±0.8，模型组微血管平均数量为每视野下2.2±0.2，显著低于正常组（P＜0.001）；与模型组相比，脉管复康片高剂量组微血管数量显著增加，中、低剂量组作用均不明显。见图4、图5。
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3 讨论
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严重下肢血管病变往往使患者面临截肢的风险，这不仅影响患者的生活质量，也会降低患者存活率。然而，目前治疗该病的药物种类和疗效还是十分有限，迫切需要发现更有效的药物，很多中药传统制剂在临床中具有很好的疗效，因此在开发新药的同时，对于这些中药传统制剂的研究和运用也是一个重要思路。
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图3 各组大鼠腓肠肌组织HE染色（×200）
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图4 各组大鼠腓肠肌组织CD31免疫组化染色（×200）
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图5 各组大鼠腓肠肌组织微血管数量比较
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糖尿病患者发生下肢血管病变主要是由于长期高糖环境引发了机体的内皮细胞损伤、炎性损伤、血小板聚集、黏附能力增强等一系列的异常反应。基于此，通过调节血管内皮功能，促进血管新生，从而改善血液循环，已经逐渐成为了治疗糖尿病患者下肢缺血的一个重要的方法。这个过程中需要多种相关因子协同调控，维持动态平衡。已有研究表明，血管内皮细胞分泌的ET-1是最强的缩血管因子[9-11]，TXA2也具有强烈的缩血管功能[12-14]。NO对血管舒缩有调节作用，NO生成减少会导致内皮依赖性血管舒张因子功能障碍，引发周围血管病变[15-17]。由于糖尿病患者高糖、高胰岛素的机体环境使得内皮细胞损伤，ET-1、TXA2、NO分泌失调，继而引起血液流变学紊乱以及血管内膜损伤严重导致的血管病变[18-19]。有研究表明，糖尿病也是一种慢性炎症性疾病，在糖尿病发生过程中，CRP、sVCAM-1高表达，促使白细胞黏附于血管内皮细胞，释放各种炎性介质，最终改变细胞功能，促进血管病变的发生发展[20-22]。此外，VEGF是一种在血管内皮细胞中非常活跃的生长因子，能促进血管内皮细胞的分裂和增殖，也就意味着这种因子在血管生成过程中发挥了不可替代的促进作用[23-25]。
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本研究对下肢大血管内皮损伤和微血管数量相关因子含量都进行了测定，结果显示，脉管复康片与糖痹外洗方联合给药可以提高NO、eNOS，并降低TXA2、ET-1的水平，从而发挥保护血管的作用，维护血管舒缩功能的平衡，对血管病变有良好的疗效；高、中剂量组VEGF水平显著升高，CD31表达增加也说明了联合用药对微血管新生具有促进作用。
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综上所述，脉管复康片联合糖痹外洗方对大鼠糖尿病下肢缺血具有一定疗效，且可以通过保护大血管缺血损伤及促进微血管新生的协同作用机制，改善下肢血液循环。
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摘要
目的：建立糖尿病大鼠下肢缺血模型，探究脉管复康片联合糖痹外洗方对糖尿病大鼠血管内皮损伤的疗效及其作用机制。方法：选取50只大鼠中的8只为正常对照组，余下大鼠采用高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素法建立大鼠糖尿病模型，结扎大鼠左后肢股动脉，建立下肢缺血模型。取造模成功的32只大鼠，随机分为模型组和高、中、低剂量给药组，每组8只。给药21 d后处死大鼠，取其血样及左后肢腓肠肌组织，检测血清中血栓素A2（TXA2）、内皮素（ET）-1、一氧化氮（NO）、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、血管内皮生长因子（VEGF）、血管细胞黏附分子-1（sVCAM-1）、C反应蛋白（CRP）含量；HE染色观察缺血后肢肌细胞形态；CD31免疫组织化学染色检测术侧腓肠肌微血管形成数量。结果：经给药治疗后，大鼠腓肠肌组织HE染色未见明显萎缩坏死，血管内皮功能趋于正常。与模型组相比，脉管复康片高、中、低剂量组大鼠血清中TXA2水平均显著降低（P<0.01）；eNOS水平均显著升高（P＜0.001）；ET-1水平均有下降，高剂量组最显著（P＜0.001）；高剂量组NO水平显著上升（P＜0.001）；高、中剂量组VEGF水平明显上升（P＜0.01）；免疫组化结果显示，相比于模型组大鼠，脉管复康片高剂量组腓肠肌微血管形成数量显著增加（P＜0.01）。结论：脉管复康片联合糖痹外洗方主要通过调节TXA2、ET-1、NO水平，维持血管内皮功能，并增加VEGF的表达，促进微血管新生，最终改善糖尿病后肢缺血。
Abstract
Objective To establish the hind limb ischemia model in diabetic rats and explore the effects of Maiguan Fukang tablets combined with Tangbi Waixi Prescription on vascular endothelial injury in diabetic rats and its role in promoting angiogenesis. Methods The rat diabetes model was established by high fat diet and intraperitoneal injection of streptozotocin. Based on the measurement of blood glucose levels, the successfully modeled rats were ligated with the left hind limb femoral artery to establish the lower limb ischemia model of diabetic rats. After modeling, the model rats were randomly divided into the model group, Tangbi Waixi Prescription combined with Maiguan Fukang tablets high, medium, and low dose group. After 21 days of administration, the rats were sacrificed and blood samples and left hind limb gastrocnemius muscle tissues were taken. The levels of TXA2, ET-1, NO, eNOS, VEGF, sVCAM-1, and CRP were detected by ELISA. HE staining was used to observe the morphology of muscle cells. The expression of the CD31 marked microvascular density was determined by immunohistochemical staining. Results After treatment with Maiguan Fukang Tablets combined with Tangbi Waixi Prescription, no obvious atrophy and necrosis were found in the gastrocnemius muscle tissue of rats by HE staining, and the vascular endothelial function tended to be normal. When compared with the model group, the changes of relevant indicators were as follows. The TXA2 levels in the serum of rats in the high-, medium-, and low-dose groups were significantly reduced (P<0.01). The levels of eNOS significantly increased (P<0.001). The levels of ET-1 all decreased, with the highest dose group being the most significant (P<0.001). The NO levels in the high-dose group significantly increased (P<0.001). There was a significant increase in VEGF levels in the high- and medium- dose groups (P<0.01). The immunohistochemical results showed that the high-dose group showed a significant increase in number of microvasculature formation (P<0.01). Conclusion Maiguan Fukang Tablets combined with Tangbi Waixi Prescription can maintain vascular endothelial function by regulating TXA2, ET-1 and NO levels, and promote angiogenesis by increasing the expression of VEGF, thereby improving hind limb ischemia in diabetes rats.
