在众多的多重耐药细菌中，耐药鲍曼不动杆菌已成为我国院内感染最重要的病原菌之一^[1-3]，且耐药鲍曼不动杆菌也是临床皮肤溃疡、创面感染中最常见、最难治疗的细菌之一，故而对抑制耐药鲍曼不动杆菌的研究具有深远的意义。抗菌肽是一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，其能抑制微生物生长并没有抗原性不易产生耐药^[4]，因其对某些耐药菌的杀灭作用及良好的医学应用前景而倍受重视，但抗菌肽活性较差，如何增加抗菌肽抗菌活性是目前研究热点。黄芪作为本团队固本法治疗炎症的基本核心用药，有益气箍毒的效果。为明确抗菌肽Brevinin-2Ta对耐药菌的抑制作用及中药黄芪协同作用的增效机理，采用感染耐药鲍曼不动杆菌的大鼠皮肤溃疡模型，以黄芪与抗菌肽Brevinin-2Ta协调增效为切入点，对干预后创面愈合情况、耐药鲍曼不动杆菌的carO基因表达及电镜下细菌细胞膜形态破坏等情况进行观察，以明确抗菌肽Brevinin-2Ta及中药黄芪对耐药鲍曼不动杆菌的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：雄性SPF级8周龄Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）60只，体质量250～300 g。黄芪药液：黄芪颗粒剂由天津中医药大学第一附属医院颗粒剂药房制备，每克颗粒剂相当于生药20 g。使用时将3 g黄芪颗粒剂溶解于200 mL蒸馏水中，形成生药浓度为0.3 g/mL的药液备用，大鼠的等效计量约为人体的6倍，用药计量约为3.0 g/（kg·d），即10 mL/（kg·d）。泛耐药鲍曼不动杆菌：由天津中医药大学第一附属医院细菌室分离，并由其保管、提供。医用无菌凡士林纱布油纱条：由河南新卫医疗器械有限公司生产。实验仪器：QL-902涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Centrifuge5415D离心机（德国Eppendorf公司）；NanoDrop 2000分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）；ABI7500荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；扫描电镜：韩国赛可；手术刀，灌胃针、注射器（5 mL、10 mL）、10 mL玻璃瓶、止血钳、直剪、试管、吸管等。实验试剂：超纯RNA提取试剂：TaKaRa Code D9108B；反转录试剂盒：TaKaRa code DRRO47A；Real-time PCR试剂盒：TaKaRa code DRR420A；5x RNA Loading Buffer：TaKaRa code DRR420A。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

将60只大鼠适应性喂养1周后。于背部切除皮肤层创面约3 cm×3 cm，创口内注入细菌浓度为10⁵ cfu/mL耐药鲍曼不动杆菌1 mL，自然暴露24 h后，伤口周围出现红、肿、皮温升高，脓性分泌物，轻触痛叫，做组织切片显示皮肤坏死结构不清并脱失，表面为炎性渗出物及坏死物覆盖，皮肤附属器消失，溃疡深达肌层。溃疡底部胶原纤维中纤维母细胞轻度增生，血管内皮细胞肿胀增生，大量淋巴、浆细胞及嗜酸性、中性粒细胞浸润。感染耐药鲍曼不动杆菌SD大鼠溃疡模型复制成功后，将其随机分为3组:空白组、抗菌肽组、抗菌肽+黄芪组，每组各20只。

1.2.2 抗菌肽凝胶制备

采用固相合成法得到成熟肽Brevinin-2Ta，抗菌肽Brevinin-2Ta的氨基酸序列：GILDT LKNLA KTAGK GILKS LVNTA SCKLS GQC-COOH，其含33个氨基酸和1个羟基。根据体外抑菌实验结果，制备抗菌肽浓度为512 μg/mL。

1.2.3 实验干预

空白组：在创面常规消毒后用生理盐水湿纱布外敷，外涂药物凡士林，厚约2 mm，再外敷盖干纱布，绷带包扎固定，每天换药1次。同时给予生理盐水10 mL/（kg·d）每天灌胃1次。抗菌肽组：在创面常规消毒后，创面给予抗菌肽Brevinin-2Ta外敷，厚约2 mm，再外敷盖干纱布，绷带包扎固定，每天换药1次。同时给予生理盐水10 mL/（kg·d）每日灌胃1次。抗菌肽+黄芪组：在创面常规消毒后，创面给予抗菌肽Brevinin-2Ta外敷，厚约2 mm，再外敷盖干纱布，绷带包扎固定，每天换药1次。同时予黄芪药液10 mL/（kg·d）每天灌胃1次。分别于造模后第3、15天在麻醉状态下切取创面组织0.5 cm×0.5 cm，用于PCR和扫描电镜检测。

1.3 检测分析

1.3.1 伤口愈合评估

分别于造模后第0、3、15天观察各组大鼠创面愈合情况，并用数码相机拍摄创面照片，采用Image J软件计算创面面积。

1.3.2 Real-Time PCR测定carO mRNA表达水平

向每0.1 g样品中加入2 mL RNAAiso Plus，4℃，以 12 000 r/min离心5 min，以每1 mL RNAAiso Plus加入200 μL氯仿的比例加入氯仿，4℃，以12 000 r/min离心15 min，将上层水相加入等体积异丙醇，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，加入1 mL、-20℃预冷的75%乙醇（RNase-Free水），4℃，12 000 r/min离心5 min，用RNase free 水溶解沉淀。将RNA模板、引物、5xRT Buffer和RNase-Free水溶解并置于冰上备用。向反应管中加入20 μL反应体系，进行反转录反应。用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2^-△△Ct法进行数据的相对定量分析。

1.3.3 电镜检测

将切取的伤口处组织放入戊二醛中，形成菌液。将菌液离心后换入新鲜戊二醛固定。2.5%戊二醛2~4 h，磷酸缓冲液清洗3次，1%锇酸4~6 h，缓冲液清洗3次，乙醇梯度脱水，30%、50%、70%、85%、95%各1次，100%乙醇2次，15～20 min/次，乙酸异戊酯置换2次，20 min/次。进行CO₂临界点干燥。离子溅射金后，即可进行扫描电镜观察。

1.4 统计分析

采用GraphPad Prism软件进行统计学处理。数据以$\stackrel{-}{x}\pm s$表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠创面愈合情况

治疗第3、15天，抗菌肽组、抗菌肽+黄芪组创面愈合率均高于空白组（P<0.05）。在治疗第3天，抗菌肽组与抗菌肽+黄芪组相比，创面愈合率差异无统计学意义（P>0.05）。在治疗第15天，抗菌肽+黄芪组创面愈合率高于抗菌肽组（P<0.05）。见图1、表1。

注：^a与空白组同时间比较，P＜0.05；^b与抗菌肽组同时间比较，P<0.05

2.2 各组carO蛋白表达水平比较

治疗第3、15天，抗菌肽组、抗菌肽+黄芪组carO蛋白mRNA表达水平均低于空白组（P<0.05）。在治疗第3天，抗菌肽组与抗菌肽+黄芪组相比，carO蛋白mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。在治疗第15天，抗菌肽+黄芪组carO蛋白mRNA表达水平明显低于抗菌肽组（P<0.05）。见表2。

注：^a与空白组同时间比较，P＜0.05；^b与抗菌肽组同时间比较，P<0.05

2.3 各组大鼠创面中泛耐药鲍曼不动杆菌的形态比较

第3天时，空白组仍可见完整鲍曼不动菌的菌株，表面较光滑，偶现单个细菌坏死，与周围菌体不粘连，考虑细菌自身代谢性衰亡。抗菌肽组鲍曼不动杆菌菌体表面出现凹陷，细胞膜结构破坏，菌毛异常菌体之间形成黏液丝，相互粘连。抗菌肽+黄芪组鲍曼不动杆菌可见菌体表面有类似皱褶样的凸凹不平，结构不完全，其外形不规则，伴有大量细菌坏死后的残余组织附着，菌体周围有大量黏稠物质，菌毛破坏。第15天时，空白组可见较多鲍曼不动菌的菌株，细菌干瘪凹陷，偶现完整细菌，表面较光滑，与周围菌体不粘连。抗菌肽组鲍曼不动杆菌大量死亡，有大量细菌坏死后的残余组织附着。抗菌肽+黄芪组未见明显细菌体，可见细菌死亡后坏死后的残余组织。见图2。

3 讨论

当前临床上出现了越来越多的多重耐药细菌，严重威胁着患者的生命，带来沉重的经济负担。超级细菌感染人类的情况，曾一度引起公众的恐慌。细菌广泛耐药性的产生使得新一代抗生素对细菌的抑制作用持续减弱。同时，临床常见的细菌感染程度重、组织破坏性强、多菌种协同、重复感染等情况，均对抗生素的选择和治疗方案的确定带来了及其严重的考验。世界卫生组织认为细菌耐药性已成为一个日益严重的全球性公共卫生问题。

在众多的多重耐药细菌中，耐药鲍曼不动杆菌已成为我国院内感染最重要的病原菌之一^[1-3]，被学者称为21世纪革兰阴性杆菌中的“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌”，2012年，由国内知名专家发起和起草的《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》，将耐药鲍曼不动杆菌列为我国目前最重要的“超级细菌”^[5]。且耐药鲍曼不动杆菌也是临床皮肤溃疡、创面感染中最常见、最难治疗的细菌之一，故而对抑制耐药鲍曼不动杆菌的研究具有深远的意义。

目前研究认为鲍曼不动杆菌的耐药与外膜蛋白结构及数量的改变或缺失有密切关系^[6]。外膜蛋白又称外膜孔蛋白，是存在于革兰阴性菌外膜脂质双层结构上的一种特殊的通道蛋白，位于细菌的细胞膜表面或镶嵌其中。其能形成通道、允许外分子通过脂质双层膜的蛋白^[7]。除具有常规蛋白质的功能以外，外膜蛋白还具备抗原性、很强的免疫原性，以及可与其他物质发生协同作用从而增强细菌的致病性等功能^[8]。外膜蛋白的缺失、突变和表达下降导致药物难以进入细菌细胞内，形成细菌耐药性^[9-10]。有研究显示，鲍曼不动杆菌接触四环素后，其外膜蛋白大量下调，说明外膜蛋白的表达和分泌对于细菌耐药性有重要作用^[11-12]。

在不动杆菌中发现多种孔蛋白，有研究发现carO表达数量的减少以及结构的变异表明了外膜孔蛋白在鲍曼不动杆菌的耐药机制中具有重要作用，部分阻断carO通道可以减少抗生素对细菌的渗透，导致耐药性^[13]。carO表达的减少可能由于DNA转录为mRNA的过程中carO基因片段发生了缺失、突变或插入，或者在RNA的表达过程中发生了不利于表达的变化，导致carO基因无法表达、表达降低或表达为无功能的mRNA，最终导致外膜蛋白carO的功能无法实现^[14]。近期有研究又发现，carO基因可因插入ISAba1、ISAba125和ISAba825元件而失活，导致carO基因不表达，以致外膜蛋白发生改变，从而导致耐药^[15-17]。

抗菌肽是一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，具有抑制微生物生长、并且没有抗原性不易产生耐药^[4]，因其对某些耐药菌的杀灭作用及良好的医学应用前景而倍受重视，而如何增加抗菌肽的抗菌活性，是目前研究的热点与难点。

Brevinin-2Ta属于一种分泌性抗菌肽，它是一种小分子蛋白质，具有两亲性——亲水和疏水的氨基酸残基所处的位置在空间结构中大多分布于螺旋结构的两侧，同时整体现正电性。这样的性质被认为造成了抗菌肽对病原微生物的识别和相互作用。因其同时带有阳性电荷和疏水基团，所以有能力与微生物细胞外壁的磷酸脂质体发生非特异性的直接反应^[18]。

由于抗菌肽携带正电荷，故而可以静电吸附于表面电荷为负的微生物细胞上^[19]。以革兰阴性菌为例，其外层膜表面的细菌脂多糖（LPS）富集末端可以是使抗菌肽定向分布。抗菌肽通过替换镁离子而贯穿膜表面，干扰LPS分子间的非共价桥接，从而打乱此超分子有序结构^[20]。有证据表明螺旋结构可以在与脂质体反应过程中形成，所以抗菌肽与细菌磷脂双分子膜直接反应可能也可以造成透膜穿孔效果^[21-22]。当静电吸附至膜表面时，抗菌肽首先与外层带负电荷的磷脂端反应，随后在两亲性螺旋结构的作用下，由磷脂双分子膜的疏水表面，矛向穿过膜结构。抗菌肽能够与细胞膜表面相互作用，使生物膜的通透性改变。阳离子抗菌肽的正电荷区域与细胞膜上的负电荷区域相互作用，使抗菌肽分子的疏水端插入细胞膜的脂质膜中，进而改变脂质膜结构。抗菌肽与细胞膜作用后形成跨膜电位，打破酸碱平衡，影响渗透压平衡抑制呼吸作用。总之，抗菌肽与膜的相互作用直接关系到抗菌肽的抗菌活性^[23]。

实验结果显示，结果说明单纯使用抗菌肽以及抗菌肽与黄芪联用都能有效促进感染鲍曼不动杆菌的大鼠创面愈合。在愈合早期（第3天），单纯使用抗菌肽或是抗菌肽与黄芪联用无明显区别；而在愈合晚期（第15天），抗菌肽与黄芪联用的效果更明显，作用更持久。第3天时抗菌肽及抗菌肽与黄芪联用组对细菌有显著抑制作用，电镜显示两组细菌破坏明显，两组carO基因表达水平亦显著低于模型组，而两组间的差异不大；第15天时，3组间carO基因表达较第3天无明显差异，但3组间差异显著：carO基因表达水平抗菌肽组较抗菌肽+中药组高，可能与抗菌肽中药合用组细菌已大量坏死有关，中药黄芪对外源性抗菌肽具有一定的增效作用。

参考文献