创面不愈为外科治疗难题，据统计占外科总住院人数1.5%~3%^[1]。而发于下肢的难愈性创面又因其易溃、难敛、易反复发作、病程长、严重者导致骨髓炎、少数有癌变可能等特点^[2-3]，严重影响患者的生活质量及身心健康，已经成为临床亟待解决的问题。西医治疗多集中于抗感染、生物敷料、负压吸引治疗、抗生素骨水泥、高压氧、植皮及皮瓣修复、手术等治疗措施，有一定疗效，但缺乏安全有效的加速创面愈合的积极措施^[4]。经过多年的临床实践^[5-6]和实验研究^[7-9]发现，中医药对下肢难愈性创面有良好的治疗作用，能促进肉芽生长、加速创面愈合、减缓瘢痕形成。根据中医“脾为气血生化之源”、“脾主肌肉”、“补虚生肌”理论，本课题组前期研究运用补脾生肌类的中药复方“四君子加川牛膝方”治疗下肢难愈性创面取得了良好效果^[10-11]，但其促进创面肉芽生长、调控成纤维细胞增殖的机制尚不明确，本研究通过动物实验探讨“四君子加川牛膝方”、“四君子汤”基于P38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）/细胞周期蛋白D1（cyclinD1）-细胞周期素依赖性激酶4（CDK4）通路促进难愈性创面愈合的机制，并初步探讨川牛膝引经作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

64 只12周龄雄性SPF级SD大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，体质量210～278 g，平均（234.05±26.91）g。实验动物许可证号为：SCXK（沪）2008-0016。

1.1.2 主要试剂及仪器

1.1.2.1 药物来源及制剂加工

四君子汤（出自《太平惠民和剂局方》）：党参（代人参）9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草6 g。实验所用中药由上海中医药大学附属龙华医院制剂室提供，中药按照传统工艺制成水煎剂，依据《中药药理研究方法学》计算人鼠等效剂量为2.97 g/kg，并按传统工艺制成水煎剂，并减压浓缩，浓度为0.30 g/mL。四君子加川牛膝方：党参（代人参）9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草6 g，川牛膝30 g组成，人鼠等效剂量为5.67 g/kg，减压浓缩至浓度为0.57 g/mL。川牛膝方由川牛膝30 g组成，换算人鼠等效剂量至2.7 g/kg，并减压浓缩，浓度为0.27 g/mL。氢化可的松琥珀酸钠注射剂，批号为20100524，购自天津生物化学制药有限公司。戊巴比妥钠，批号为20100312，购自美国Sigma公司。

1.1.2.2 主要实验试剂

抗体Anti-Cyclin D1（1︰100），批号Ab61758，抗体Anti-CDK4（1:150），批号Ab7955，购自英国Abcam公司；大鼠血小板衍化生长因子（PDGF）的ELISA试剂盒，批号201501231，购自上海西唐生物科技有限公司；Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）抗体，批号4511，购自美国Cell Signaling Technology公司。柠檬酸钠缓冲溶液，批号BYL40864，购自上海基尔顿生物科技有限公司；PBS，批号BYL40657，购自上海基尔顿生物科技有限公司；二甲苯，批号10023418，购自上海国药集团；苏木精，批号H8070-5，购自上海索莱宝生物科技有限公司。胎牛血清，批号10099-141，购自美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶，批号BYL40926，购自上海基尔顿生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，批号PICPI23223，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；蛋白预染Marker，批号SM1811，购自加拿大Fermentas公司；NC膜，批号HATF00010，购自美国millipore公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，批号G2003，购自于中国谷歌生物科技有限公司。

1.1.2.3 主要实验仪器

C6流式细胞仪，购自美国BD公司；Thermo Labsystems洗板机，购自芬兰雷勃公司；MK3酶标仪，购自芬兰雷勃公司；H1650-W微量高速离心机，购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司； GHP-9160隔水式恒温培养箱，购自中国上海一恒公司；HI1210水浴锅，购自意大利莱卡公司； P20移液器，购自法国吉尔森公司。

1.2 实验方法

1.2.1 建立大鼠难愈性创面模型

参照相关文献^[12-13]进行动物模型的制备，实验前12 h实验大鼠禁食，给予定量饮水。实验当日称大鼠体质量，按40 mg/kg体质量进行3%戊巴比妥钠溶液单次腹腔注射，待麻醉满意，用电推剪在大鼠的造模区（右侧臀腿部位）剃毛，在造模区予直径25 mm的塑料瓶盖做标记。无菌条件下，用外科方法作深达深筋膜、直径为25 mm全层皮肤缺损。再按照80 mg/kg的体质量行氢化可的松琥珀酸钠的单次腹腔内注射，制成大鼠下肢难愈性创面的模型。

1.2.2 实验动物分组及给药方法

64 只模型大鼠随机分成4组：四君子加川牛膝方组、四君子汤组、生理盐水组、川牛膝组，每组16只。大鼠分笼单独饲养。于造模后次日，各组开始灌胃给药，分别给予生理盐水组给予四君子加川牛膝方中药、四君子汤中药、生理盐水、川牛膝中药灌胃，每次2 mL，1次/d。各组于造模后局部创面换药，换药前以1∶5 000呋喃西林溶液创面清洁，单层的生理盐水纱布进行湿敷（将生理盐水纱布剪成创面的大小），后在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布固定。见图1。

1.2.3 标本采集

将每组动物随机分成2批。分别于造模后第7天、14天取材。各组大鼠分别于造模后第7、14天，以单次腹腔内注射戊巴比妥钠（40 mg/kg体质量）麻醉后，用眼科手术剪剪取创缘0.5 cm以内肉芽组织，放入冻存管内，粘贴标记，超低温冰箱保存。同时并行腹主动脉抽血，抽取8 mL血液，放入抗凝管，粘贴标记，超低温冰箱保存。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 免疫组织化学方法检测细胞周期蛋白D1/细胞周期素依赖性激酶4（CyclinD1/CDK4）水平

脱蜡、水化，PBS洗两次各5 min，用蒸馏水或PBS配置新鲜的3% H₂O₂，室温封闭5～10 min，蒸馏水洗3次，抗原修复，PBS洗5 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体，滴加抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1︰50），室温1 h，4℃过夜后37℃复温1 h，PBS洗3次每次2 min，滴加生物素化二抗，20～37℃20 min，PBC洗3次每次2 min，滴加试剂SABC，20～37℃ 20 min，PBS洗4次每次5 min，DAB显色5～10 min，在显微镜下掌握染色程度，蒸馏水洗，苏木精复染2 min、盐酸酒精分化，脱水、透明、封片、镜检。通过显微镜、图像采集卡、数码相机采集数字图像、数字图像为标准的jpg文件格式。选用显微镜目镜×10倍数，距离测量定标用显微镜专用校正微尺来标定。步骤是先点击图像中微尺上的两个点，再将它的实际微米数输入计算机，计算机自动计算得到比例因子后存储备用。消除背景把免疫组化中的紫色背景从图像上去除。用鼠标器选择棕黄色或棕褐色阳性区域，处理后有效阳性区域用红色表示。此功能可和选阴性区域功能交替使用。测量方式可选全视场测量。否则，需选择测量区域（用鼠标选择任意区域或选择矩形区域）。测量免疫组化图像中阳性区域面积及平均光密度（OD）值。每张照片至少分析3个视野。单位换算：总面积=351000像素点；阳性面积1个像素点= 0.095 μm ²。免疫组化指数=阳性面积×OD值。

1.3.2 Western blot法检测P38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）水平

组织块用冷TBS洗涤2～3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积抽提试剂，于冰上彻底匀浆。匀浆液转移至1.5 mL离心管中，振荡。冰浴30 min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。12 000 ×g离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。采用Bradford蛋白浓度测定，制作蛋白浓度-吸光度曲线。900 μL Bradford加入1 L待测蛋白和99 μL 0.9%生理盐水，混匀后在595 nm处检测吸光度。根据标准品做出的标准曲线上计算出各样本蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，每个样品上样量均为40 μg，在蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液使其终浓度为1×，95~100℃处理5 min。配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀。灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。加入1×电泳缓冲液，将样品加入点样孔中。准备6张7 cm×9 cm的滤纸和一张大小适中的0.45 μm PVDF膜，甲醇活化。按照200 mA、1 h的条件转膜。将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶（0.5%TBST配）封闭1 h。先后予稀释一抗（TBST溶解的5%脱脂牛奶），4℃过夜。用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min。将二抗用TBST稀释3 000倍，室温下孵育30 min，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min。等体积混匀A和B两种试剂，均匀滴加到膜的蛋白面侧，保持1～2 min，去尽残液，保鲜膜塑封，放入X线片夹中曝光。根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS17.0进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示。组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组P38MAPK表达水平比较

造模后7 d，四君子汤组、四君子加川牛膝方组P38MAPK表达水平明显高于生理盐水组，差异有统计学意义（P<0.01）；川牛膝方组与生理盐水组间P38MAPK表达水平无明显差异（P>0.05）；四君子加川牛膝方组与四君子汤组间P38MAPK表达水平无明显差异（P>0.05）。造模后14 d，4组间P38MAPK表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表1，图2。

注：^a与生理盐水组比较，P<0.01

2.2 各组CyclinD1免疫组化指数比较

造模后第7、14天，4组间CyclinD1的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2，图3、4、5。

2.3 各组CDK4免疫组化指数的比较

造模后第7、14天，4组间CDK4的表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3，图6、7、8。

3 讨论

下肢难愈性溃疡属于中医“溃疡”“臁疮”范畴，多发于老年人或素体亏虚的患者，病程长，创面经久不愈。“祛腐生肌”为溃疡治疗法则，根据“脓、腐、肌”及创周情况确定时机，腐肉脱尽，邪毒已净，局部见“疮口下陷，久不收口，腐肉已脱，起白色厚边，脓液稀少，肉芽灰白”等气血亏虚之象，应加用补益生肌之品助机体加速生肌敛疮^[14]。依据“脾主肌肉”，“脾主运化”，“脾为气血生化之源”的理论，在补益气血治疗中尤其重视脾胃，“四君子汤”由人参（代以党参）、白术、茯苓、甘草四味药物组成，是益气健脾经典方剂。方中党参甘温，补中益气；茯苓甘淡，健脾渗湿；白术苦温，健脾燥湿，加强益气助运之力；炙甘草甘温，益气和中，调和诸药。《医方集解》云此方“气足脾运，饮食倍进，则余脏受荫，而色泽身强矣”。临床^[10]及实验^[11]研究发现，四君子汤治疗下肢皮肤溃疡，可明显提高创面愈合速度、缩短创面愈合时间。

引经药能达到交通上下、畅达气机作用^[15]。牛膝为苋科植物牛膝的干燥根，主要含有多糖、多肽、三萜皂苷类、酮甾类、甾醇类、生物碱类等化学成分，现代药理学认为牛膝有调节免疫相关细胞、抗炎等作用^[16]，历代本草多谓牛膝“性善下行”，善于治疗“病在下”的疾患，四君子加川牛膝方，由益气健脾经典方剂“四君子汤”与中药川牛膝组成，以补虚生肌为治疗原则，加川牛膝为引经药以引药下行，可促使药力直达病所，促进创面愈合。有研究进一步证实，与四君子汤相比，四君子加川牛膝方可以明显提高创面愈合速度，缩短创面愈合时间^[10]。

难愈性创面的修复是由多种组织、细胞、细胞因子等参与的连续复杂过程，任何环节功能障碍，如修复信号传导通路异常、创面修复细胞增殖和凋亡异常等均能影响创面愈合^[14]。创面愈合过程包括炎症期、增殖期和重塑期，免疫系统功能状态与创面修复密切相关^[17]，成纤维细胞增殖迁移、肉芽组织生长及以胶原为主的细胞外基质沉积在创面修复增殖期和重塑期发挥重要作用^[18-19]。P38MAPK是MAPK四条信号通路之一，可以介导转化生长因子-β1（TGF-β1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等细胞因子的信号转导，在组织再生、创伤愈合等细胞增殖反应过程中被活化，参与细胞发育、生长、分裂及细胞间功能的同步等多种生理过程^[20]，与组织修复的结局和质量关系密切^[21]。本研究证实，造模后第7天，四君子汤组、四君子加川牛膝方组P38MAPK的表达明显高于生理盐水组，激活细胞内MAPK信号通路，引发一系列连锁反应，同时P38MAPK存在于成纤维细胞等大多数细胞内^[22]，其作用时间点可能发生在细胞周期的有丝分裂期，参与细胞的生长、分裂、发育等生理过程，从而促进创面愈合。同时，P38MAPK具有拮抗炎症介质的作用，对炎症分子的表达有明显影响；有研究发现，p38MAPK途径的激活抑制了肿瘤坏死因子引起的炎症反应^[23]。从而补益生肌类复方四君子汤从创面愈合炎症、增殖两个阶段进行干预，促进了创面愈合。

细胞增殖是通过细胞周期的正常运转而实现的，而细胞周期运转主要受周期调节蛋白如细胞周期蛋白依赖激酶、细胞周期素的精准调控，两者各有多个种类，交叉配伍。其中以CyclinD1、CDK4等G1期调节蛋白在在G1/S期作用点调控最为重要^[24]。前期研究证实^[25]，造模后第7天，四君子汤组G0/G1期细胞比例降低，而S期细胞比例升高；四君子汤组纤维蛋白原增殖活性明显高于生理盐水组，四君子汤能提高成纤维细胞S期细胞比例，促进成纤维细胞增殖。但同时研究证实^[26]，在细胞周期调控中，CDK4的过度表达，可导致细胞分化与增殖失控，增加细胞癌性转化的风险。本实验中四君子汤与生理盐水组比较，CyclinD1与CDK4的表达无明显差异。其原因有待于进一步的深入研究，推测可能与活化的CyclinD1-CDK4表达有关，或是与其他细胞周期素与细胞周期蛋白依赖激酶的交叉调控有关。但也同时提示补虚生肌类中药四君子汤在促进创面愈合的同时，没有导致CDK4的过度表达，致使细胞增殖、分化失控，增加细胞癌变的风险。

综上，补虚生肌复方四君子汤及四君子加川牛膝方通过上调PDGF等细胞因子的合成和分泌，共同调控P38MAPK/CyclinD1-CDK4信号转导通路，加速成纤维细胞由G0/G1期进入S期，促进成纤维细胞的增殖，促进创面肉芽组织增生，填充组织缺损，从而促进创面愈合。川牛膝引经作用的机制可能是通过提高成纤维细胞S期细胞比例，促进成纤维增殖而发挥的协同作用，其机制有待于进一步的深入研究。

参考文献