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糖尿病是一种慢性代谢性疾病，其中糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是其严重并发症之一，病情发展后期常常导致患者被迫截肢，极大地影响了患者的生活质量。因此，开发促进糖尿病足创面愈合的药物具有重要的经济价值和社会意义[1-2]。
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糖尿病足溃疡患者因代谢异常引起下肢动脉血管病变，导致血流量减少，降低生长因子活性并阻止血管新生，严重阻碍创面愈合；其次，创面一旦形成，极易受金黄色葡萄球菌感染，促进炎症反应，造成恶性循环。目前临床上尚缺乏针对糖尿病足溃疡治疗的有效药物[3]。复方黄柏液由黄柏、连翘、金银花、蒲公英、蜈蚣五味中药组成，其功能主治为清热解毒、消肿祛腐，减轻伤口感染等[4]。现代药理学研究表明，该复方具有广谱抑菌作用，消炎镇痛，抗溃疡，加快伤口愈合[5]。
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网络药理学是将传统药理学与生物信息学和计算机网络结合在一起的新兴药理学研究方法。由于中药复方成分多，靶点多，故传统药理研究难以阐明其具体机制，网络药理学可通过收集药物成分靶点与疾病靶点之间的关系，整体性和系统性地研究药物与疾病间的作用，从而预测中药的分子作用机制[6]。本研究通过网络药理学和实验研究探讨复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡的作用机制。
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1 网络药理学研究
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1.1 复方黄柏液活性成分靶点筛选及“活性成分-靶点”网络图构建
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以黄柏、连翘、金银花、蒲公英、蜈蚣为关键词，通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/），以口服生物利用度（OB）≥30%、类药相似度（DL）≥0.18为条件，检索有效化合物成分及靶点信息。查阅以往发表的文献和资料补充有效成分，并利用SwissADME化学成分预测平台（http://www.swissadme.ch/）筛选符合条件的成分，并通过PharmMapper（http://lilab.ecust.edu. cn/pharmmapper/index.php）获得潜在靶点信息，利用 Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）将靶点统一为基因名，使用Cytoscape3.9.1 构建有效成分-靶点网络图。
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1.2 糖尿病足溃疡疾病靶点筛选
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通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传 （online mendelian inheritance in man，OMIM，https: //omim.org/）数据库，以“diabetic foot ulcers”为关键词检索疾病的靶点信息，利用Uniprot对靶点进行标准化。
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1.3 药物有效成分与疾病交集靶点的筛选及蛋白相互作用（PPI）网络构建
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利用Venny 2.1.0（https: //bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html） 对药物有效成分靶点和DFU靶点进行重合，得出二者交集靶点，将交集靶点上传至STRING11.0（https:// www.string-db.org/） 平台，物种限定为“Homo sapiens”，置信分数跃0.4，获得PPI，并导入Cytoscape3.9.1软件进行可视化，使用CytoNCA功能筛选关键靶点。
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1.4 GO功能分析和KEGG通路富集分析
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将关键靶点基因导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，进行生物学过程富集分析（GO）和KEGG通路富集分析，根据核心通路富集程度探讨复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡的可能作用机制。
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2 实验研究
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2.1 实验动物
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雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，体质量（260±20）g，由沈阳药科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽）2020-0001，动物质量合格证号：210726211100601251。饲养环境：室温20~25℃，12 h无光照/12 h人工光照，标准饲料喂养，自由饮水。实验程序遵循沈阳药科大学实验动物中心提供的指导原则。
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2.2 药品与试剂
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复方黄柏液涂剂（山东汉方制药有限公司，规格：150 mL/瓶，国药准字Z 10950097，批号：202312）；金黄色葡萄球菌（沈阳药科大学微生物教研室提供）；链脲佐菌素（STZ，大连美仑生物技术有限公司，批号:01030A）；柠檬酸（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号:20201123）；柠檬酸钠 （天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号 : 20201003）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20220123）；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自武汉博士德有限公司。
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2.3 主要仪器
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多功能酶标仪（赛默飞科技有限公司）、血糖仪（罗氏血糖健康医护公司）、组织自动脱水机及石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）、石蜡切片机（上海莱卡显微系统有限公司）。
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2.4 动物分组及造模
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2.4.1 动物分组
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将30只健康SD大鼠分为正常溃疡组、糖尿病溃疡模型组和复方黄柏液治疗组，每组10只。
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2.4.2 糖尿病模型的建立
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除正常溃疡组外，其他两组大鼠均一次性腹腔注射55 mg/kg剂量的浓度为 1%的STZ。正常溃疡组腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。诱导7 d后，自尾静脉采血，测量随机血糖，以随机血糖≥16.7 mmol/L并出现多饮、多食、多尿现象为糖尿病模型建立成功的标准。
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2.4.3 糖尿病足溃疡模型的建立
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麻醉糖尿病模型建立成功的大鼠，将5 g圆形砝码置于酒精灯上方烘烤20 s，待炙热后接触右足背部皮肤15 s，并于足趾部注射0.1 mL金黄色葡萄球菌。烫伤部位出现肿胀，水泡，24 h后溃疡创面形成，即成功建立糖尿病足溃疡模型[7-8]。
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2.5 实验给药
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模型建立成功次日开始药物治疗，正常溃疡组及糖尿病溃疡模型组给予20 mL生理盐水冲洗创面，给药组给予20 mL复方黄柏液冲洗溃疡表面。每天给药1次，连续给药28 d。
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2.6 检测指标
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末次给药后，将所有大鼠麻醉，剪切溃疡创面周围组织，用4%多聚甲醛固定，进行病理学检测；ELISA法检测白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子 （TNF）-α、血管内皮生长因子 （VEGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的含量。
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2.7 统计学分析
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实验结果使用SPSS 25.0进行统计学分析，并使用Graphpad prism 7.0 进行统计学绘图。计量资料以 表示，多样本间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
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3 结果
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3.1 药物活性成分靶点的获取及活性成分-靶点网络构建
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经筛选后共获得药物有效成分88种，合并后删除重复值共得到靶点 518 个，利用 Cytoscape3.9.1软件构建药物活性成分-靶点网络 （图1）。该网络由604个节点和2 732条边组成，反映了化合成分与作用靶点的相互作用。
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图1 复方黄柏液活性成分-靶点网络图
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3.2 糖尿病足溃疡疾病潜在靶点
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通过OMIM获取糖尿病足溃疡疾病靶点279个，GeneCards获取糖尿足病溃疡疾病靶点2 509个，筛掉重复靶点后，共有2 739个糖尿病足溃疡疾病靶点。
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3.3 药物与疾病共同靶点筛选及互作网络构建
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Venny2.1.0分析得到药物与疾病共同作用靶点225 个，并绘制Venny图，获得的交集靶点基因导入 STRING数据库，获得PPI网络图，网络共有225个节点，4 813条边，平均节点数为42.8，见图2。
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图2 药物和疾病交集靶点Venny图
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3.4 靶蛋白相互作用 PPI 网络分析
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利用Cytoscape3.9.1软件对PPI网进行网络拓扑分析，得到224个节点，4 813条边。根据CytoNCA网络节点的计算结果，筛选出AKT1、TNF、TP53、IL-6、VEGFA、 JUN、CASP3、CTNNB1、IL1B、SRC、MMP9、MYC、FN1、 EGF、CXCL8为核心靶点。PPI网络及关键靶点筛选见图3，靶点信息见表1。
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图3 核心靶点网络图
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3.5 GO功能富集分析
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通过DAVID数据库对复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡的作用靶点进行GO功能富集分析，在GO分析条目中，分别选取生物过程 （biological process，BP）、细胞组成（cellular components，CC）、分子功能（molecular function，MF） 中显著性排名前10的功能信息绘制柱状图，如图4，分析得到BP主要涉及细胞因子介导的信号通路、基因表达的正向调控、凋亡过程的正调控等。CC主要涉及细胞外隙、胞外区、大分子复合物等。MF主要涉及蛋白质结合、细胞因子活性、生长因子活性等。
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图4 复方黄柏液治疗DFU的GO功能富集分析
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3.6 KEGG通路富集分析
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通过DAVID数据库对复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡的作用靶点进行KEGG 通路富集分析，共获得88条信号通路（ P<0.05），结果按照P值从小到大排序，取排名前20条通路绘制 KEGG气泡图，主要涉及MAPKA信号通路、TNF信号通路、脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路和 AGE-RAGR信号通路等（图5）。
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图5 复方黄柏液治疗DFU的KEGG通路富集分析
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3.7 复方黄柏液对大鼠血清中VEGF及EGF含量的影响
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与正常溃疡组比较，糖尿病溃疡组血清中的 VEGF及EGF含量明显降低；与糖尿病溃疡组相比，复方黄柏液治疗组血清中的VEGF和EGF水平均明显升高，差异有统计学意义，见图6。
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图6 各组大鼠血清中VEGF、EGF表达水平比较
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3.8 复方黄柏液对糖尿足溃疡大鼠血清中炎性因子的影响
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与正常溃疡组相比，糖尿病溃疡组血清中的炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平升高；黄柏液治疗组血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比糖尿病溃疡组明显降低，差异有统计学意义，见图7。
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图7 各组大鼠血清中炎性因子含量比较
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3.9 复方黄柏液对糖尿病足溃疡大鼠肉芽组织生成的影响
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正常溃疡组结构完整，肉芽组织增加，成纤维细胞排列完整，数量较多，毛细血管增多（图8A）。糖尿病溃疡组表皮轮廓模糊，成纤维细胞数量减少，排列混乱，可见炎症细胞浸润，肉芽组织及新生毛细血管较少（图8B）。黄柏液治疗组表皮界限清楚，肉芽组织及新生毛细血管增加，成纤维细胞排列规则，数量增加，炎症细胞减少（图8C）。
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图8 各组大鼠足部溃疡组织病理检查结果（HE染色，×200）
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4 讨论
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糖尿病足患者多有血管、神经病变，足部创面常伴随氧化应激、糖基化终末产物、炎性因子等微环境异常，这些因素可使创面迁延不愈，其中血管病变及炎症反应是延长伤口愈合的关键因素[9]。
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复方黄柏液由黄柏、连翘、金银花、蒲公英、蜈蚣五味中药组成。传统中医药理论认为黄柏及连翘在此方中共为君药，具有清热解毒、排脓散结的作用，并享有“疮疡灵药”的美誉；金银花和蒲公英在此方中共为臣药，主要助君药排毒，解热之功。蜈蚣可攻毒散结、退炎治疮[10]。中药复方具有多成分、多靶点等特性，因此要阐明其作用机制需要大量的实验研究。本文通过网络药理学方法构建药物与疾病之间的作用靶点网络信息进行预测，最终确定 AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、JUN、CASP3、CTNNB1、 IL1B、SRC、MMP9、MYC、FN1、EGF、CXCL8作为复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡的关键靶点，富集分析显示MAPKA信号通路、TNF信号通路、脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、AGE-RAGR信号通路是该复方发挥作用的主要通路。
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炎症反应在创面愈合过程中起着重要作用，创面愈合困难与反复的炎症反应以及细胞增殖和重塑期延迟有关，因此本研究通过实验发现糖尿病足溃疡组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子分泌增多，加重组织损伤，创口愈合减慢，给予复方黄柏液治疗后，大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平比糖尿病足溃疡组显著降低，该结果与网络药理学预测一致，表明复方黄柏液可减轻糖尿病足溃疡大鼠的炎症反应。
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血管生成是伤口愈合过程中必不可少的过程， VEGF和EGF在促进血管新生中起着关键作用， VEGF和EGF可激活 MAPK 通路诱导细胞分化[11]。糖尿病足溃疡患者由于组织供血供氧不足，抑制了 VEGF和EGF的表达与生成[12-13]，导致新生血管形成受损，使伤口的愈合延迟，因而上调VEGF和EGF可以有效治疗糖尿病足溃疡[14-15]。有研究表明，复方黄柏液对难愈性蛇伤溃疡具有较好的治疗效果，可明显升高体内VEGF、EGF和成纤维细胞生长因子 （FGF）的含量，从而促进血管重塑，加速伤口愈合[16]。本研究结果提示，复方黄柏液可显著提高糖尿病足溃疡组大鼠血清中VEGF及EGF的含量，与文献报道一致。病理结果提示，复方黄柏液可增加糖尿病足溃疡大鼠创面中成纤维细胞和新生毛细血管的数量，促进肉芽组织生成，进一步证实了复方黄柏液对糖尿病足溃疡愈合的促进作用。
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综上所述，复方黄柏液涂剂可通过多靶点、多通路促进糖尿病足溃疡创面愈合，其机制可能通过炎症信号通路、MAPKA信号通路及其他通路发挥作用。动物实验结果表明，复方黄柏液可以降低炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，提高VEGF和EGF的表达。此研究为复方黄柏液治疗糖尿病足溃疡提供了实验±据，其具体机制还需进一步研究。
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摘要
目的：利用网络药理学和实验研究探讨复方黄柏液涂剂对糖尿病足溃疡的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库（TCMSP）检索复方黄柏液中药有效成分及相关靶点，应用GeneCards和OMIM数据库搜索糖尿病足溃疡疾病靶点，使用 Cytoscape 3.9.1构建“活性成分-靶点”网络图，利用Venny 2.1.0选取药物成分和疾病交集靶点，将交集靶点导入STRING 11.0平台构建蛋白互作网络（PPI）；通过DAVID 数据库进行GO生物功能和KEGG通路富集分析。实验研究选取30只SD大鼠，随机分为正常溃疡组、糖尿病溃疡组及复方黄柏液治疗组，每组10只。ELISA法检测各组大鼠血清中白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、血管内皮生长因子（VEGF）和表皮细胞生长因子（EGF）表达情况，HE染色法观察各组大鼠足部溃疡愈合情况。结果：网络药理学共检索到复方黄柏液88种有效成分，有效成分作用靶点518个；检索到药物和疾病交集靶点225个；通过分析得到 TNF-α、IL-6、VEGFA、IL-1β、EGF、CXCL8等15个关键靶点；GO功能富集分析主要包括细胞因子活性、生长因子活性等多种功能途径；KEGG通路富集分析主要包括MAPKA信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGR信号通路等。动物实验结果显示，复方黄柏液可显著降低血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，提高VEGF和EGF的表达；HE染色结果表明复方黄柏液治疗后大鼠足溃疡中肉芽组织及成纤维细胞含量显著增加。结论：复方黄柏液可通过多途径、多靶点、多通路治疗糖尿病足溃疡，复方黄柏液通过降低血清中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，提高血清中VEGF和EGF表达量，加速肉芽组织生成，促进糖尿病足溃疡的愈合。
Abstract
Objective To explore the therapeutic effect of compound Phellodendri liquid in treating diabetic foot ulcer (DFU) based on network pharmacology and experimental study. Methods The active components and related targets of Compound Phellodendri Liquid were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology database and analysis platform (TCMSP). GeneCards and OMIM databases were used to search for diabetic foot ulcer disease targets. The network diagram of “active ingredient -target”was constructed by Cytoscape 3.9.1 software. Intersection targets between drug components and disease was taken by Venny 2.1.0 to and the common target protein interaction network was constructed by STRING 11.0 database platform. GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed by DAVID database. Thirty SPF Sprague-Dawley （SD）male rats were randomly divided into normal ulcer group, diabetic foot ulcer group and Phellodendri Liquid treatment group, with 10 rats in each group. The expression levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, VEGF and EGF were detected by ELISA and foot ulcer healing was observed by HE staining. Results 88 active ingredients and 518 active ingredient targets were retrieved by the network pharmacology and 225 drug active ingredients and disease intersection targets were retrieved. 15 key targets were obtained, including TNF -α, IL -6, VEGFA, IL -1β, EGF,CXCL8, etc. GO function enrichment analysis included positive regulation of cytokine activity and growth factor activity. KEGG pathway enrichment analysis included MAPKA signaling pathway, TNF signaling pathway, IL-17 signaling pathway and AGE-RAGR signaling pathway. The results of animal experiments indicated that compared with diabetic foot ulcer group the levels of VEGF and EGF were increased and the contents of inflammatory factors TNF-α, IL-6 and IL-1β were significantly decreased in Phellodendri liquid treatment group. HE staining revealed that compared with diabetic foot ulcer group the contents of granulation tissue and fibroblast were increased in the treatment group. Conclusion Compound Phellodendron liquid can treat diabetic foot ulcers through multiple pathways, multiple targets and multiple pathways It is verified that compound Phellodendron liquid promots the healing of diabetic foot ulcers by reducing the levels of inflammatory factors TNF-α, IL-6 and IL-1β and increasing the expression of VEGF and EGF to accelerate granulation tissue production.
